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huaizhenkai新虫 (小有名气)
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目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？ 已有4人参与
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鄙人刚开始接触蛋白纯化，碰到的问题如下还忘各位高手踊跃回答。 我的目的蛋白包含10His tag，分子量约32kd。首先利用FF镍柱纯化后的结果见图1右边两条带：可见除目的蛋白之外，还有两条杂蛋白带（约70kd和110kd左右）；再查询文献之后（目的蛋白为老靶点蛋白，已经有人纯化过该蛋白），决定尝试Superdex 75 10/300 GL（全新的）利用AKTA purifier分离纯化，吸收图结果如图2（忘记保存了，大概峰形见手绘图），按照峰形接收蛋白洗脱液时，将洗脱液接收为12管，每管200-500 微升不等，然后跑SDS-PAGE胶结果如图3，蛋白完全没分开啊？？因此问题如下： 1. 杂蛋白按照分子量来像目的蛋白的二三聚体，怎么确定？ 2. Superdex 75柱子分离范围为3-70 kd，理论上只要杂蛋白和目的蛋白分子量差一倍就可以使用该柱子分离，但是为什么我的蛋白完全没有分开？从峰开始，中间，结尾分开接收的11 管洗脱液跑出来的胶完全一个样子，都是三条带？ 3，看了几篇质量还可以的文献，他们都是过了镍柱和分子筛，纯度就可以上核磁了，我这分子筛完全分不开，是我实验过程中出了问题，还是。。？ 忘高手指点啊  1 镍柱纯化结果.jpg  2. AKTA吸收峰图.jpg  3. Superdex 75 洗脱液胶图  1.镍柱纯化结果.jpg |
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xuweitao
铁杆木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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huaizhenkai: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-26 10:41:35
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huaizhenkai: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-26 10:41:35
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1. PAGE上样的buffer是否含有还原性的DTT或者巯基乙醇？如果没有，加点试试。蛋白可能通过二硫键形成多聚体，跟是否SDS变性无关@二楼。当然你也可以做WB，你的蛋白含有HIS-tag。这样可以判断其他两个是否也是你的蛋白多聚体。 2. 按照你的描述，这些蛋白都一起下柱的话，如果不是你上样量过大的话，还有另外一种可能是这些蛋白和你的蛋白结合，比如是伴侣蛋白。DnaK和GroES都是70KDa左右。你也可以跑非变性胶判断。 3. 这个很难说，建议你试试我上面讲的。当然，你是土豪的话直接做核磁看个二维HSQC也可以判断吧：）。 |
5楼2016-09-25 18:30:23
fuyuandj86
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【答案】应助回帖
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1. SDS-PAGE 是变性胶，大多数情况二三聚体不会出现。 2. 不要贪图产率，收两个峰中间的组分。 纯度第一，产率第二。试下只收第一个峰的前一半。 3. 实在不行就换实验方法，比如用钴柱取代镍柱。或者N端一个标签，C端再来个纯化标签 |
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huaizhenkai2楼2016-09-25 08:09:15
fuyuandj86
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3楼2016-09-25 08:10:41
4楼2016-09-25 15:18:00
