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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by milamiya at 2016-09-26 10:48:09
采用Superdex G75 理论上确实是可以分开的，但那只是理论。个人观点哈，不到万不得已不要使用分子筛，这个虽然简单，但是如果分子量差异没有那么明显的话分离度不会很好的，对于做工艺开发而言，不考虑收率和成本是 ...

谢谢你的答复，我可以试一下离子交换柱，看看是不是二三聚体，如果真是二三聚体应该是分不开的。
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好好学习，天天向上！
11楼2016-09-26 12:51:32
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by huaizhenkai at 2016-09-26 11:11:52
你好，谢谢你的解答。
1. Buffer中是有1mM DTT的。不好意思，不太明白你说的？你说的Western blotting方法，因为我的目的蛋白含有His-tag就可以区分二三聚体了？？聚体区分原理是什么，可以说的详细一些吗？
2.  ...

1. WB看看两个大小的位置是否都有你的tag。如果都有，就很有可能是多聚体。
2. 主要是看是否高于柱子饱和上限了，你如果担心可以降低上样量。非变性胶就是native-page。
3. 拿到二维应该可以很容易分辨出大概的氨基酸个数，特别是想色氨酸这种，出峰位置特别，可以数出来的。如果样品中有大量其他蛋白，很容易就辨认出来了。至于多聚体之类的，估计要区分比较困难。

另外楼下说的离子交换你可以试试，蛋白分离无外乎就是亲和柱，离子交换柱和分子筛三种手段。
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12楼2016-09-26 13:27:07
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liu-chuan

铁虫 (初入文坛)
280不准的，除非是抗体，重组蛋白最好用考马斯亮蓝法

发自小木虫Android客户端
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13楼2016-09-26 16:39:14
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by xuweitao at 2016-09-26 13:27:07
1. WB看看两个大小的位置是否都有你的tag。如果都有，就很有可能是多聚体。
2. 主要是看是否高于柱子饱和上限了，你如果担心可以降低上样量。非变性胶就是native-page。
3. 拿到二维应该可以很容易分辨出大概的氨 ...

好的，谢谢。目前我可以先降低下上样量，再过一下Superdex 75试一下看能不能分开；如果同样还是这三条带的话，再检测是否为多聚体和尝试离子交换柱分离。有问题再请教您！谢谢
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好好学习，天天向上！
14楼2016-09-27 15:13:22
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