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huaizhenkai

新虫 (小有名气)

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虫号: 1184607
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[求助] 目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？已有4人参与

鄙人刚开始接触蛋白纯化，碰到的问题如下还忘各位高手踊跃回答。
我的目的蛋白包含10His tag，分子量约32kd。首先利用FF镍柱纯化后的结果见图1右边两条带：可见除目的蛋白之外，还有两条杂蛋白带（约70kd和110kd左右）；再查询文献之后（目的蛋白为老靶点蛋白，已经有人纯化过该蛋白），决定尝试Superdex 75 10/300 GL（全新的）利用AKTA purifier分离纯化，吸收图结果如图2（忘记保存了，大概峰形见手绘图），按照峰形接收蛋白洗脱液时，将洗脱液接收为12管，每管200-500 微升不等，然后跑SDS-PAGE胶结果如图3，蛋白完全没分开啊？？因此问题如下：

1. 杂蛋白按照分子量来像目的蛋白的二三聚体，怎么确定？
2. Superdex 75柱子分离范围为3-70 kd，理论上只要杂蛋白和目的蛋白分子量差一倍就可以使用该柱子分离，但是为什么我的蛋白完全没有分开？从峰开始，中间，结尾分开接收的11 管洗脱液跑出来的胶完全一个样子，都是三条带？

3，看了几篇质量还可以的文献，他们都是过了镍柱和分子筛，纯度就可以上核磁了，我这分子筛完全分不开，是我实验过程中出了问题，还是。。？

忘高手指点啊

1 镍柱纯化结果.jpg