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wh7690703木虫 (正式写手)
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[交流]
如何扩增高GC含量的模板！
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各位高手们注意了，我有个问题想请教大家！ 本人之前一直在P富含GC的模板，使用了LA-Taq及其GC Buffer（本身含有DMSO和甘油）和slowdown PCR，都没有将其扩增出来。也重新设计了引物，仍然扩增不出。 我都不知道该怎么办了，哪位高手知道的话，帮忙啊 小弟不甚感激~ 注：模板为链霉菌基因组 梯度和Touchdown PCR及热启动PCR都做过 [ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 12:41 ] |
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2楼2008-11-17 22:48:46
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3楼2008-11-17 23:10:07
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4楼2008-11-17 23:17:39
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GC Buffer有两种，一个DMSO含量高，一个低些 所以调整GC Buffer不太可能 Mg2+浓度又怎么调啊，它可是跟在GC Buffer里的(Mg2+浓度为5mM) 50ul体系加入GC Buffer体积为25ul，也就是说Mg2+浓度为2.5mM。dNTP(2.5mM)加入8ul，即浓度为0.4mM。 PCR反应体系( 50μl)： TAKARA LA-Taq 5U/μl 0.5μl 2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ (5mM Mg2+) 25μl Genomic DNA 1μl dNTP Mixtures (各2.5mM) 8μl 上游引物 (20μM) 1μl 下游引物 (20μM) 1μl 无菌水 12.5μl 总体积 50μl 不知这样的体系合适不？ |
5楼2008-11-17 23:47:06
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6楼2008-11-18 00:09:32
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7楼2008-11-18 12:22:08
。你看看引物 buffer有没问题。 8楼2008-11-19 00:46:55
9楼2008-11-19 00:49:51
10楼2008-11-19 16:39:33