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wh7690703

木虫 (正式写手)

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在线: 518.8小时
虫号: 565722
注册: 2008-05-29
专业: 食品加工技术

[交流] 如何扩增高GC含量的模板！

各位高手们注意了，我有个问题想请教大家！
本人之前一直在P富含GC的模板，使用了LA-Taq及其GC Buffer（本身含有DMSO和甘油）和slowdown PCR，都没有将其扩增出来。也重新设计了引物，仍然扩增不出。
我都不知道该怎么办了，哪位高手知道的话，帮忙啊
小弟不甚感激~
注：模板为链霉菌基因组
梯度和Touchdown PCR及热启动PCR都做过

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 12:41 ]

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1楼 2008-11-17 22:45:14

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wh7690703

木虫 (正式写手)

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虫号: 565722
注册: 2008-05-29
专业: 食品加工技术

GC Buffer有两种，一个DMSO含量高，一个低些
所以调整GC Buffer不太可能
Mg2+浓度又怎么调啊，它可是跟在GC Buffer里的(Mg2+浓度为5mM)
50ul体系加入GC Buffer体积为25ul，也就是说Mg2+浓度为2.5mM。dNTP(2.5mM)加入8ul，即浓度为0.4mM。
PCR反应体系( 50μl)：
   TAKARA LA-Taq       5U/μl             0.5μl
   2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ (5mM Mg2+)    25μl
   Genomic DNA                               1μl
   dNTP Mixtures    (各2.5mM)          8μl
   上游引物             (20μM)             1μl
   下游引物             (20μM)             1μl
   无菌水                                        12.5μl
   总体积                                        50μl
不知这样的体系合适不？