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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 wh7690703 的 4 个金币

wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 如何扩增高GC含量的模板!

各位高手们注意了,我有个问题想请教大家!
本人之前一直在P富含GC的模板,使用了LA-Taq及其GC Buffer(本身含有DMSO和甘油)和slowdown PCR,都没有将其扩增出来。也重新设计了引物,仍然扩增不出。
我都不知道该怎么办了,哪位高手知道的话,帮忙啊
小弟不甚感激~
注:模板为链霉菌基因组
梯度和Touchdown PCR及热启动PCR都做过

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 12:41 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
换酶~~
KOD FX Taq似乎说很牛X
不过没试过
价钱,还好啦
2楼2008-11-17 22:48:46
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wh7690703

木虫 (正式写手)

楼上的兄弟,除了换酶还有其他的好方法吗?
3楼2008-11-17 23:10:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

要不就只好自己调DMSO和Mg2+的浓度了
但是这是一个痛苦的过程
DMSO浓度太高太低都出不来,一般以1%为梯度慢慢摸
Mg2+太高太低也不行,以0.5mM为梯度摸
4楼2008-11-17 23:17:39
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wh7690703

木虫 (正式写手)

GC Buffer有两种,一个DMSO含量高,一个低些
所以调整GC Buffer不太可能
Mg2+浓度又怎么调啊,它可是跟在GC Buffer里的(Mg2+浓度为5mM)
50ul体系加入GC Buffer体积为25ul,也就是说Mg2+浓度为2.5mM。dNTP(2.5mM)加入8ul,即浓度为0.4mM。
PCR反应体系( 50μl):
     TAKARA LA-Taq        5U/μl              0.5μl
     2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ   (5mM Mg2+)       25μl
     Genomic DNA                                 1μl
     dNTP Mixtures       (各2.5mM)           8μl
     上游引物               (20μM)               1μl
     下游引物               (20μM)               1μl
     无菌水                                          12.5μl
     总体积                                          50μl
不知这样的体系合适不?
5楼2008-11-17 23:47:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


wh7690703(金币+1,VIP+0):xiexie
很难讲
其实,难扩的模板,我用takara的酶就是扩不出来…………
我换了酶就一直很稳定,还没遇到扩不出来的……
我用的是Invitrogen的白金高保真的Taq
还有promega的GoTaq
你的模板GC%有多大?
6楼2008-11-18 00:09:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

要不试试KOD的Taq酶,KOD FX
号称可以扩GC%到90%的片段
7楼2008-11-18 12:22:08
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RecA

金虫 (小有名气)

我们实验室也都是扩正高GC含量的基因组,就用takara的试剂La-tag,甚至普通tag酶,GCI,好像没有出现lz那样批不出来的现象。现在我们用百泰克的LA-tag也一样能p出来的。你看看引物 buffer有没问题。
8楼2008-11-19 00:46:55
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RecA

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
我一般用的体系是     TAKARA LA-Taq        5U/μl              0.5μl
     2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ   (5mM Mg2+)       25μl
     Genomic DNA                                 1μl
     dNTP Mixtures       (Takara 10mM)           2.5μl
     上游引物               (10μM)               2.5μl
     下游引物               (10μM)               2.5μl
     无菌水                                          11μl
     总体积                                          50μl


你看看模板,引物有没问题哦。

[ Last edited by RecA on 2008-11-19 at 00:51 ]
9楼2008-11-19 00:49:51
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克伦蒂亚

木虫 (小有名气)

谢谢大家的积极回复
我用的体系跟RecA的差不多
关于引物:我之前用过简并引物,P了,GC buffer1,P出许多非特异性带,目的带也有,后把目的带切胶回收连接转化测序,测序结果出来:完全不匹配。
用GC buffer2的P,带是少了,可就是没有目的带。
现在改用特异性引物(参照文献提供的),使用2种GC buffer,并使用Slowdown PCR,结果啥都P不出来,  
伤心啊
10楼2008-11-19 16:39:33
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