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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何扩增高GC含量的模板！
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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 如何扩增高GC含量的模板！

各位高手们注意了，我有个问题想请教大家！
本人之前一直在P富含GC的模板，使用了LA-Taq及其GC Buffer（本身含有DMSO和甘油）和slowdown PCR，都没有将其扩增出来。也重新设计了引物，仍然扩增不出。
我都不知道该怎么办了，哪位高手知道的话，帮忙啊
小弟不甚感激~
注：模板为链霉菌基因组
梯度和Touchdown PCR及热启动PCR都做过

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 12:41 ]
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1楼 2008-11-17 22:45:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
换酶~~
KOD FX Taq似乎说很牛X
不过没试过
价钱，还好啦
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2楼2008-11-17 22:48:46
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wh7690703

木虫 (正式写手)
楼上的兄弟，除了换酶还有其他的好方法吗？
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3楼2008-11-17 23:10:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
要不就只好自己调DMSO和Mg2+的浓度了
但是这是一个痛苦的过程
DMSO浓度太高太低都出不来，一般以1%为梯度慢慢摸
Mg2+太高太低也不行，以0.5mM为梯度摸
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4楼2008-11-17 23:17:39
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wh7690703

木虫 (正式写手)
GC Buffer有两种，一个DMSO含量高，一个低些
所以调整GC Buffer不太可能
Mg2+浓度又怎么调啊，它可是跟在GC Buffer里的(Mg2+浓度为5mM)
50ul体系加入GC Buffer体积为25ul，也就是说Mg2+浓度为2.5mM。dNTP(2.5mM)加入8ul，即浓度为0.4mM。
PCR反应体系( 50μl)：
     TAKARA LA-Taq        5U/μl              0.5μl
     2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ   (5mM Mg2+)       25μl
     Genomic DNA                                 1μl
     dNTP Mixtures       (各2.5mM)           8μl
     上游引物               (20μM)               1μl
     下游引物               (20μM)               1μl
     无菌水                                          12.5μl
     总体积                                          50μl
不知这样的体系合适不？
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5楼2008-11-17 23:47:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
wh7690703(金币+1,VIP+0):xiexie
很难讲
其实，难扩的模板，我用takara的酶就是扩不出来…………
我换了酶就一直很稳定，还没遇到扩不出来的……
我用的是Invitrogen的白金高保真的Taq
还有promega的GoTaq
你的模板GC%有多大？
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6楼2008-11-18 00:09:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
要不试试KOD的Taq酶，KOD FX
号称可以扩GC%到90%的片段
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7楼2008-11-18 12:22:08
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RecA

金虫 (小有名气)
我们实验室也都是扩正高GC含量的基因组，就用takara的试剂La-tag，甚至普通tag酶，GCI，好像没有出现lz那样批不出来的现象。现在我们用百泰克的LA-tag也一样能p出来的。你看看引物 buffer有没问题。
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8楼2008-11-19 00:46:55
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RecA

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
我一般用的体系是     TAKARA LA-Taq        5U/μl              0.5μl
     2xGC Buffer Ⅰ/Ⅱ   (5mM Mg2+)       25μl
     Genomic DNA                                 1μl
     dNTP Mixtures       (Takara 10mM)           2.5μl
     上游引物               (10μM)               2.5μl
     下游引物               (10μM)               2.5μl
     无菌水                                          11μl
     总体积                                          50μl


你看看模板，引物有没问题哦。

[ Last edited by RecA on 2008-11-19 at 00:51 ]
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9楼2008-11-19 00:49:51
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克伦蒂亚

木虫 (小有名气)
谢谢大家的积极回复
我用的体系跟RecA的差不多
关于引物：我之前用过简并引物，P了，GC buffer1，P出许多非特异性带，目的带也有，后把目的带切胶回收连接转化测序，测序结果出来：完全不匹配。
用GC buffer2的P，带是少了，可就是没有目的带。
现在改用特异性引物(参照文献提供的)，使用2种GC buffer，并使用Slowdown PCR,结果啥都P不出来，  
伤心啊
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10楼2008-11-19 16:39:33
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