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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何扩增高GC含量的模板！
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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 如何扩增高GC含量的模板！

各位高手们注意了，我有个问题想请教大家！
本人之前一直在P富含GC的模板，使用了LA-Taq及其GC Buffer（本身含有DMSO和甘油）和slowdown PCR，都没有将其扩增出来。也重新设计了引物，仍然扩增不出。
我都不知道该怎么办了，哪位高手知道的话，帮忙啊
小弟不甚感激~
注：模板为链霉菌基因组
梯度和Touchdown PCR及热启动PCR都做过

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 12:41 ]
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1楼 2008-11-17 22:45:14
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克伦蒂亚

木虫 (小有名气)
谢谢大家的积极回复
我用的体系跟RecA的差不多
关于引物：我之前用过简并引物，P了，GC buffer1，P出许多非特异性带，目的带也有，后把目的带切胶回收连接转化测序，测序结果出来：完全不匹配。
用GC buffer2的P，带是少了，可就是没有目的带。
现在改用特异性引物(参照文献提供的)，使用2种GC buffer，并使用Slowdown PCR,结果啥都P不出来，  
伤心啊
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10楼2008-11-19 16:39:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
换酶~~
KOD FX Taq似乎说很牛X
不过没试过
价钱，还好啦
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2楼2008-11-17 22:48:46
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wh7690703

木虫 (正式写手)
楼上的兄弟，除了换酶还有其他的好方法吗？
赞一下 回复此楼
3楼2008-11-17 23:10:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
要不就只好自己调DMSO和Mg2+的浓度了
但是这是一个痛苦的过程
DMSO浓度太高太低都出不来，一般以1%为梯度慢慢摸
Mg2+太高太低也不行，以0.5mM为梯度摸
赞一下 回复此楼
4楼2008-11-17 23:17:39
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