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一起来旅行

银虫 (正式写手)

[求助] 为啥总反反复复PCR总是扩不出目的条带 已有1人参与

刚来的引物第一次摸剃度的时候条带可亮了,但是后来一直重复怎么也扩不出来目的条带,反而引物二聚体特别的亮。然后又重新总trizol提RNA,浓度1000ng/ul,A260/280为1.79,A230/260为0.9,然后逆转录后浓度4000多ng/ul,然后还是按之前的程序跑PCR,结果仍然没有目的条带,表示心很累啊,求大神指导

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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pangadmire

铁虫 (小有名气)

请问你逆转录后浓度怎么测的?

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2楼2016-07-24 00:44:58
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一起来旅行

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pangadmire at 2016-07-24 00:44:58
请问你逆转录后浓度怎么测的?

我们实验室有测浓度的仪器

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3楼2016-07-24 09:12:46
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pangadmire

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 一起来旅行 at 2016-07-24 09:12:46
我们实验室有测浓度的仪器
...

nanodrop?用这个测的?

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4楼2016-07-24 14:46:36
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柳梢月

金虫 (小有名气)

同样的问题,一开始有条带,后来怎么搞都没有了,反复换了引物模板,都不出条带

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5楼2016-07-24 18:17:26
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houfuyuan

新虫 (小有名气)

确认RNA提取成功后,反转录时分别用随机引物与oligo引物。
玉无瑕,青春无华。
6楼2016-07-24 19:20:09
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一起来旅行

银虫 (正式写手)

RNA浓度的1247.1ng/ul,OD值260/280为1.74,230/260为1.05,然后逆转录后的cDNA的浓度4637.6ng/ul,OD值260/280为1.71,230/260为1.97,然后就是扩不出来,真的心累啊

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7楼2016-07-24 19:49:32
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安静de执着14

新虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 一起来旅行 at 2016-07-24 19:49:32
RNA浓度的1247.1ng/ul,OD值260/280为1.74,230/260为1.05,然后逆转录后的cDNA的浓度4637.6ng/ul,OD值260/280为1.71,230/260为1.97,然后就是扩不出来,真的心累啊

是不是模板浓度过大,你减少模板用量再试试。

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8楼2016-07-24 22:48:07
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做个剃度试一下呗。Tm为引物退火温度加减5度

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9楼2016-07-25 22:21:12
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一起来旅行

银虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by Bioexperixgs at 2016-07-25 22:21:12
做个剃度试一下呗。Tm为引物退火温度加减5度

之前做出来了剃度,就一直用那个退火温度扩,然后就在没有然后了

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10楼2016-07-25 23:52:17
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