应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光PCR咨询-不胜感激
71/1返回列表
查看: 1048  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jinling158

铜虫 (小有名气)

[求助] 实时荧光PCR咨询-不胜感激 已有2人参与

我最近正研制细菌实时荧光PCR检测试剂盒，但是碰到了一些问题，两三个月之前做出的灵敏度还可以，但三个月之后就灵敏度降低了，Ct值增加了2~3，但是试剂什么的都没有变啊。我用的ABI预混液，难道是酶降解了（一直按照说明书4度保存，但其中有一晚上冰箱坏了第2天上午修好了，这个应该不会有影响吧）？另外，难道引物探针也降解了？引物探针的纯化方式是PAGE，这种纯化方式是不是没有离子交换HPLC的纯度和稳定性好啊？都是PAGE纯化，不同公司合成的探针质量是不是不一样呢？宝生物销售跟我说他们合成的探针质量好。又或是我的DNA降解了？对于低浓度的质粒DNA，有没有好的保存方法啊？比如说用低吸附的管子，里面要加一些什么样的保护剂吗？负20度还是负80度保存呢？
  
谢谢各位！对您的答复不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2016-07-18 21:15:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:03
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2016-07-22 14:08:08
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

tjabhm


发自小木虫Android客户端
3楼2016-08-01 09:53:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingdee

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:26
我也一直在做Ct相关的qPCR,有几种原因可能导致Ct靠后：
1.探针最好是HPLC纯化方式，PAGE对探针来说纯化不够，引物PAGE纯化OK，不同厂商合成的有差异，TAKARA算不错的。
2.引物探针用TE溶解，并分装，减少反复冻融，探针分装于棕色不透明管防止荧光标记降解。
3.模板降解：尽量用高浓度质粒保存于-20度，少冻融，用于做灵敏度的质粒浓度肯定很低，易降解，最好每次都用高浓度来现配现用。

希望对你有用。
赞一下 回复此楼
4楼2016-08-05 17:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-11-14 07:41:25
灵敏度降低时很正常的，我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况，产品正式输出以前，都会做稳定性实验的，反复冻融，实时稳定性，开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次，但是实际上有的冻融2次不光Ct值延后，而且荧光增峰也会下降。
我想问一下你的ABI预混液是放到哪里保存的？酶是单独添加的吗？
我们调试试剂用的buffer和酶等原料都是自己配置的。
荧光PCR检测试剂盒最重要的两部分，一是探针引物的设计合成。二是酶反应体系。你可以一项项的排除一下
赞一下 回复此楼
5楼2016-08-08 10:12:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinling158

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 足下客 at 2016-08-08 10:12:49
灵敏度降低时很正常的，我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况，产品正式输出以前，都会做稳定性实验的，反复冻融，实时稳定性，开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次，但是实际上有的冻 ...

ABI预混液放在4度保存的，预混液中已经有酶了
赞一下 回复此楼
6楼2016-08-15 20:30:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

timero

新虫 (小有名气)
肯定是探针的问题，PAGE过程使荧光素发生了光热漂白，损伤了荧光素。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-11-14 07:25:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jinling158 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +12 archvillain 2026-08-15 23/1150 2026-08-15 20:47 by foyo404
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭