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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光PCR咨询-不胜感激
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jinling158

铜虫 (小有名气)

[求助] 实时荧光PCR咨询-不胜感激 已有2人参与

我最近正研制细菌实时荧光PCR检测试剂盒，但是碰到了一些问题，两三个月之前做出的灵敏度还可以，但三个月之后就灵敏度降低了，Ct值增加了2~3，但是试剂什么的都没有变啊。我用的ABI预混液，难道是酶降解了（一直按照说明书4度保存，但其中有一晚上冰箱坏了第2天上午修好了，这个应该不会有影响吧）？另外，难道引物探针也降解了？引物探针的纯化方式是PAGE，这种纯化方式是不是没有离子交换HPLC的纯度和稳定性好啊？都是PAGE纯化，不同公司合成的探针质量是不是不一样呢？宝生物销售跟我说他们合成的探针质量好。又或是我的DNA降解了？对于低浓度的质粒DNA，有没有好的保存方法啊？比如说用低吸附的管子，里面要加一些什么样的保护剂吗？负20度还是负80度保存呢？
  
谢谢各位！对您的答复不胜感激！
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1楼 2016-07-18 21:15:53
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匿名

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:03
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2楼2016-07-22 14:08:08
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tjabhm


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3楼2016-08-01 09:53:30
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qingdee

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:26
我也一直在做Ct相关的qPCR,有几种原因可能导致Ct靠后：
1.探针最好是HPLC纯化方式，PAGE对探针来说纯化不够，引物PAGE纯化OK，不同厂商合成的有差异，TAKARA算不错的。
2.引物探针用TE溶解，并分装，减少反复冻融，探针分装于棕色不透明管防止荧光标记降解。
3.模板降解：尽量用高浓度质粒保存于-20度，少冻融，用于做灵敏度的质粒浓度肯定很低，易降解，最好每次都用高浓度来现配现用。

希望对你有用。
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4楼2016-08-05 17:15:15
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-11-14 07:41:25
灵敏度降低时很正常的，我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况，产品正式输出以前，都会做稳定性实验的，反复冻融，实时稳定性，开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次，但是实际上有的冻融2次不光Ct值延后，而且荧光增峰也会下降。
我想问一下你的ABI预混液是放到哪里保存的？酶是单独添加的吗？
我们调试试剂用的buffer和酶等原料都是自己配置的。
荧光PCR检测试剂盒最重要的两部分，一是探针引物的设计合成。二是酶反应体系。你可以一项项的排除一下
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5楼2016-08-08 10:12:49
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jinling158

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 足下客 at 2016-08-08 10:12:49
灵敏度降低时很正常的，我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况，产品正式输出以前，都会做稳定性实验的，反复冻融，实时稳定性，开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次，但是实际上有的冻 ...

ABI预混液放在4度保存的，预混液中已经有酶了
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6楼2016-08-15 20:30:57
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timero

新虫 (小有名气)
肯定是探针的问题，PAGE过程使荧光素发生了光热漂白，损伤了荧光素。

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7楼2016-11-14 07:25:49
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