应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光PCR咨询-不胜感激
51/1返回列表
查看: 966  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

jinling158

铜虫 (小有名气)

[求助] 实时荧光PCR咨询-不胜感激 已有2人参与

我最近正研制细菌实时荧光PCR检测试剂盒，但是碰到了一些问题，两三个月之前做出的灵敏度还可以，但三个月之后就灵敏度降低了，Ct值增加了2~3，但是试剂什么的都没有变啊。我用的ABI预混液，难道是酶降解了（一直按照说明书4度保存，但其中有一晚上冰箱坏了第2天上午修好了，这个应该不会有影响吧）？另外，难道引物探针也降解了？引物探针的纯化方式是PAGE，这种纯化方式是不是没有离子交换HPLC的纯度和稳定性好啊？都是PAGE纯化，不同公司合成的探针质量是不是不一样呢？宝生物销售跟我说他们合成的探针质量好。又或是我的DNA降解了？对于低浓度的质粒DNA，有没有好的保存方法啊？比如说用低吸附的管子，里面要加一些什么样的保护剂吗？负20度还是负80度保存呢？
  
谢谢各位！对您的答复不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2016-07-18 21:15:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingdee

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:26
我也一直在做Ct相关的qPCR,有几种原因可能导致Ct靠后：
1.探针最好是HPLC纯化方式，PAGE对探针来说纯化不够，引物PAGE纯化OK，不同厂商合成的有差异，TAKARA算不错的。
2.引物探针用TE溶解，并分装，减少反复冻融，探针分装于棕色不透明管防止荧光标记降解。
3.模板降解：尽量用高浓度质粒保存于-20度，少冻融，用于做灵敏度的质粒浓度肯定很低，易降解，最好每次都用高浓度来现配现用。

希望对你有用。
赞一下 回复此楼
4楼2016-08-05 17:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

匿名

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:03
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2016-07-22 14:08:08
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

tjabhm


发自小木虫Android客户端
3楼2016-08-01 09:53:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-11-14 07:41:25
灵敏度降低时很正常的，我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况，产品正式输出以前，都会做稳定性实验的，反复冻融，实时稳定性，开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次，但是实际上有的冻融2次不光Ct值延后，而且荧光增峰也会下降。
我想问一下你的ABI预混液是放到哪里保存的？酶是单独添加的吗？
我们调试试剂用的buffer和酶等原料都是自己配置的。
荧光PCR检测试剂盒最重要的两部分，一是探针引物的设计合成。二是酶反应体系。你可以一项项的排除一下
赞一下 回复此楼
5楼2016-08-08 10:12:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭