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jinling158

铜虫 (小有名气)

[求助] 实时荧光PCR咨询-不胜感激 已有2人参与

我最近正研制细菌实时荧光PCR检测试剂盒,但是碰到了一些问题,两三个月之前做出的灵敏度还可以,但三个月之后就灵敏度降低了,Ct值增加了2~3,但是试剂什么的都没有变啊。我用的ABI预混液,难道是酶降解了(一直按照说明书4度保存,但其中有一晚上冰箱坏了第2天上午修好了,这个应该不会有影响吧)?另外,难道引物探针也降解了?引物探针的纯化方式是PAGE,这种纯化方式是不是没有离子交换HPLC的纯度和稳定性好啊?都是PAGE纯化,不同公司合成的探针质量是不是不一样呢?宝生物销售跟我说他们合成的探针质量好。又或是我的DNA降解了?对于低浓度的质粒DNA,有没有好的保存方法啊?比如说用低吸附的管子,里面要加一些什么样的保护剂吗?负20度还是负80度保存呢?
  
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jinling158

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 足下客 at 2016-08-08 10:12:49
灵敏度降低时很正常的,我们公司研发生产的试剂盒有些也会出现这种情况,产品正式输出以前,都会做稳定性实验的,反复冻融,实时稳定性,开瓶稳定性等。我们说明书上会 要求反复冻融不能超过三次,但是实际上有的冻 ...

ABI预混液放在4度保存的,预混液中已经有酶了
6楼2016-08-15 20:30:57
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匿名

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:03
本帖仅楼主可见
2楼2016-07-22 14:08:08
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3楼2016-08-01 09:53:30
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qingdee

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-05 22:47:26
我也一直在做Ct相关的qPCR,有几种原因可能导致Ct靠后:
1.探针最好是HPLC纯化方式,PAGE对探针来说纯化不够,引物PAGE纯化OK,不同厂商合成的有差异,TAKARA算不错的。
2.引物探针用TE溶解,并分装,减少反复冻融,探针分装于棕色不透明管防止荧光标记降解。
3.模板降解:尽量用高浓度质粒保存于-20度,少冻融,用于做灵敏度的质粒浓度肯定很低,易降解,最好每次都用高浓度来现配现用。

希望对你有用。
4楼2016-08-05 17:15:15
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