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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 酿酒酵母感受态细胞电击转化
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母感受态细胞电击转化 已有1人参与

各位师兄师姐大神好，我现在是研一的学生，因为本科完全没有接触过分子生物学的东西，我本科是读中药学的。导师安排我做萜类的异源表达，用的菌是酿酒酵母BY4741，我之前制备了感受态细胞，但是当时做的时候没有测最终的OD值，就开始做感受态了。后来做完后，就有Bio-rad的电转仪进行电转，然后涂板。在这个过程中，有些问题并不是很清楚，所以想请教一下你们：
（1）制备酵母感受态细胞时，最终的OD值是不是一定要达到1.3~1.5之间？超过了会有什么影响？
（2）电转时，我选择的电击杯是0.2的，我参照protocol上写是0.2的电击杯加40u的感受态和5u的DNA样品，混合静置后加入电击杯中，发现量太少了，是不是需要调整一下感受态细胞的用量？还是需要加入山梨醇来增大体积？
（3）电击后，加入1ml的山梨醇，转移到无菌的EP管中后，是否需要孵育一段时间？之前做大肠杆菌的时候是需要孵育的，酵母的话是不是也需要？
（4）涂板后，一般需要多久时间才会长出菌落？一般菌落数是多少？
问题比较多，希望各路大神帮忙解决一下，谢谢@天使托
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1楼 2016-07-11 21:28:28
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
刚做实验会遇到各种各样的问题，没有人能够给你全部解答。那么我们能做的就是严格参照protocol进行，并阅读大量文献（有时候比问人来的更通透一些），所谓萧规曹随是也。时间久了，自己就能够有体会了。读研究生了，不管是勺子还是筷子，必需自己拿了。
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一品黄山
2楼2016-07-12 11:58:32
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ls2046 at 2016-07-12 11:58:32
刚做实验会遇到各种各样的问题，没有人能够给你全部解答。那么我们能做的就是严格参照protocol进行，并阅读大量文献（有时候比问人来的更通透一些），所谓萧规曹随是也。时间久了，自己就能够有体会了。读研究生了， ...

有道理 受教了

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3楼2016-07-12 18:43:40
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ls2046 at 2016-07-12 11:58:32
刚做实验会遇到各种各样的问题，没有人能够给你全部解答。那么我们能做的就是严格参照protocol进行，并阅读大量文献（有时候比问人来的更通透一些），所谓萧规曹随是也。时间久了，自己就能够有体会了。读研究生了， ...

但是很多情况都找不到protocol 有时候真的很急 又没有人指导你

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4楼2016-07-16 15:24:18
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kingjazz23 at 2016-07-16 15:24:18
但是很多情况都找不到protocol 有时候真的很急 又没有人指导你
...

很多protocol 都在文献里，追查原始文献是一种方法，还有就是一些提供质粒或宿主细胞的公司，他们都会提供完整的技术资料。
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一品黄山
5楼2016-07-17 09:06:24
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jldu0606

铁杆木虫 (著名写手)
个人经验：
(1)酿酒酵母感受态OD值最好是1.0左右，超过一点影响不大。但是当培养液明显发白的时候，最好不要做感受态了。
（2）45ul的转化体系对于0.2电击杯来说是有点少，我之前是用醇沉质粒，加入100ul感受态细胞的的转化体系。仅供参考
（3）电击后，加入一定体积的山梨醇，直接可以涂板。
（4）一般的情况36h左右可以看见细小的单克隆细胞，48h之后就可以挑取并培养了。
以上仅供参考
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6楼2016-07-28 11:33:22
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dushangyun

金虫 (小有名气)
你的OD值可以不在这个范围，这个范围的酵母一般是指数生长，用来做感受态比较好，电专的体积基本没有问题，电专后加山梨醇补充到1.5ml就好了，孵育4h左右，浑浊就可以了，一般的酵母生长3到5天就可以看到菌落了。最后，想问一下，你的BY4741可以交换一点吗？我有GS115和一些大肠杆菌质粒？？？？万分感谢！！！
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经不住逝水流年，逃不过此间少年
7楼2016-09-14 09:18:56
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学习有助成功

铜虫 (小有名气)
请问酿酒酵母电转化需要对质粒单酶切线性化吗

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8楼2017-09-11 10:23:30
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符运会

新虫 (初入文坛)
请问，有已验证很好用的整个流程吗

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9楼2017-11-24 18:29:00
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