24小时热门版块排行榜

返回列表

莓林塔

木虫 (小有名气)

应助: 8 (幼儿园)
金币: 2661
散金: 20
红花: 2
帖子: 212
在线: 62.4小时
虫号: 2423107
注册: 2013-04-14
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 汉逊酵母电击转化不长啊有人能帮忙分析分析么！！

不知道各位做没做过汉逊酵母，本人最近正在做一个汉逊酵母的电击转化，质粒和酵母是人家之前公司做过配套的，就是一套的东西，所以我不可以换酵母。。
1.5 kV，200欧姆，25 uF，时间基本都是4.7s
但是不长啊！！具体步骤是这么做的：
质粒用sac1线性化，37度2h，电泳图感觉并没有完全切开，但是肯定有一部分是切开了，线性化条带明显增多，
把大约5ug的质粒和当天做的感受态混合，冰上静止5min
把混合物转移到2mm电转杯杯底，电击，迅速把1ml山梨醇倒入电转杯，再吸出来30度静止2h，然后加入1mlYPD，30度，180rpm，1.5h，
取400ul涂平板，30度温育。
我的平板是按照网上的protocol配制的，由于质粒上有ura3基因，所以我的平板是尿嘧啶缺陷的，大概内容就是含硫酸铵的YNB，各种氨基酸，腺嘌呤，但是没有尿嘧啶，葡萄糖（我的葡萄糖是单独配制的，115度30分钟高压了两次，看性状没有明显的变化，还是透明无色的，会不会有很严重的影响啊？？？）
感受态就是按照经典的酿酒酵母感受态那么做的，就是乙酸锂，DTT消化之后的OD=0.8的酵母细胞，重悬于山梨醇里，全程冰上操作，动作轻柔，现做现用！
我发帖子的主要目的是对于质粒线性化那里不太理解，对汉逊酵母的机理也不太理解，各位有没有明白的啊，到底是不是同源重组啊？我这里就不是特别明白，而且这个酵母是别人从公司拿来的，根本就没有信息，我知道的所有信息就是这是一种汉逊酵母，就没了啊，质粒也是别人构建好的，确定能用的，所以很是纠结啊，希望各位高手能帮帮小妹这个忙啊！！！

回复此楼