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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 真核细胞高效表达蛋白的方法
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 真核细胞高效表达蛋白的方法 已有2人参与

有人知道真核细胞有没有高效表达蛋白的办法？我想提高蛋白表达量，一般真核表达只能达到Wetern blot检测的级别，但是我想要多表达一些蛋白，想要做免疫动物用的抗原（原核表达可溶性差，我想要可溶蛋白）。目前已知的SF9昆虫细胞系表达量较高，但是要转好几次质粒，还要转病毒，太繁琐，有没有相对简单一点的办法？
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1楼 2016-06-20 12:02:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wochong

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weizhi111: 金币+4, ★★★很有帮助 2016-06-21 07:41:01
您好，蛋白的话，看蛋白序列，如果能用原核做当然是最好的，根据我的经验，如果是制备抗原的话完全没有必要用真核细胞做 真的 我们做个好多蛋白（大于几百个了），基因优化表达条件优化纯化优化，做出来的蛋白作为抗原是肯定没有问题的，至于你说的可溶性，应该这样说，只要是重组蛋白都必须是可溶性的，但是是不是上清就不能混为一谈了，上清是指原核表达上清中获得的蛋白，简单来说就是上清一定是可溶性的，但可溶性不一定是来源于上清，有时候获得了包涵体，但是只要成功复性，去做抗原肯定是可以的，但是要作为其他的比如制药啊之类的对蛋白要求高的，就不行了，
另外真核的话，瞬时转染本身表达就低，但是东西好啊（好是好但是你不需要用这个的 真的）条件当然是很难优化的  我们也做过不少的哺乳动物细胞表达的蛋白也都成功了 但是成本太高 养细胞就不容易啊~
真的 我们做过几千个蛋白了 制备蛋白作为抗原去打动物的 就有几百个 你的蛋白可溶性差完全就是你自己的实验没有优化到最优条件  记住 一定要从序列开始优化 密码子的简并性~
以上都是真心话希望对你有所帮助~
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3楼2016-06-20 16:24:04
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wochong

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
weizhi111: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，你觉得包涵体做出来的抗体能做IP和ChIP实验吗？我的抗体不能做啊 2016-06-23 07:56:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by weizhi111 at 2016-06-21 21:47:03
谢谢你的回复，关于优化密码子和复性的事我再考虑考虑。您说的原核表达蛋白作为抗原和抗体反应检测相互作用，测亲和力什么的都可以，你们原核表达的是上清还是包涵体蛋白？我要做的抗体确实是研究分子间相互作用的 ...

上清包涵体都可以做，反正蛋白都是可溶的，做分子间相互作用的话，如果只是想定性分析可以做IP验证一下即可，但是如果是测亲和力什么定量分析的话，IP是不行的，Fortebio可以进行定量定性分析
真核细胞高效表达蛋白的方法
分子间相互作用.png
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9楼2016-06-22 09:00:18
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以提供蛋白表达纯化技术服务

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2楼2016-06-20 12:25:09
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wochong at 2016-06-20 16:24:04
您好，蛋白的话，看蛋白序列，如果能用原核做当然是最好的，根据我的经验，如果是制备抗原的话完全没有必要用真核细胞做 真的 我们做个好多蛋白（大于几百个了），基因优化表达条件优化纯化优化，做出来的蛋白作为抗 ...

非常感谢你真诚的回答，我的蛋白用包涵体做过抗体，确实如你所说，抗体能杂出条带，但我想做IP，ChIP等实验，这样的抗体不能用于这种识别高级结构的实验。我还是想要上清中的蛋白来制备单抗。另外你说的包涵体复性，我感觉也比较困难（我试过），要怎样才算复性成功了呢？我的蛋白不是酶，没有检测活性的办法，所以个人感觉这种方式不太好说。还有，怎样优化序列才能使蛋白的可溶性变好？有没有预测的软件？我觉得密码子无论怎么改，蛋白质序列还是一样的啊，蛋白可溶性为什么会改变呢？
谢谢你耐心回答！！
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4楼2016-06-21 07:49:14
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wochong

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weizhi111 at 2016-06-21 07:49:14
非常感谢你真诚的回答，我的蛋白用包涵体做过抗体，确实如你所说，抗体能杂出条带，但我想做IP，ChIP等实验，这样的抗体不能用于这种识别高级结构的实验。我还是想要上清中的蛋白来制备单抗。另外你说的包涵体复性 ...

谢谢您真诚的回复~
蛋白表达密码子优化肯定是非常非常重要的，根据密码子的简并性，同一个蛋白是对应三种密码子的（M起始密码子除外啊），所以不同的表达系统是有自己的密码子偏爱性的，举例酪氨酸对应4中密码子：CCU,CCC,CCA,CCG，无论密码子怎么不一样反正对应的蛋白是一样的都是酪氨酸，但是大肠杆菌系统可能只喜欢 CCA密码子不喜欢CCU呢，这样你就需要把CCU换成CCA去基因合成啊，就是想这个意思，可能不是正确的哈，另外除此之外，优化的还有mRNA结构优化，这些都是为了提高蛋白在上清中表达量的，，一般如果蛋白序列如果好优化的话，上清是能够得到的，还是看蛋白序列~还有你这个蛋白有没有人做过,你看看相关文献~
包涵体复性，你试过比较难很正常，你也不是专业做蛋白的，复性需要掌握的火候太多，精准，没有足够的经验很难尝试成功的~
你说的IP实验，是研究抗原抗体特异性结合的，是想要做分子间相互作用吗？
我们刚刚做过这个实验，原核表达蛋白作为抗原和抗体反应检测相互作用，测亲和力什么的，是完全可以的。
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5楼2016-06-21 10:25:51
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wochong at 2016-06-21 10:25:51
谢谢您真诚的回复~
蛋白表达密码子优化肯定是非常非常重要的，根据密码子的简并性，同一个蛋白是对应三种密码子的（M起始密码子除外啊），所以不同的表达系统是有自己的密码子偏爱性的，举例酪氨酸对应4中密码子： ...

谢谢你的回复，关于优化密码子和复性的事我再考虑考虑。您说的原核表达蛋白作为抗原和抗体反应检测相互作用，测亲和力什么的都可以，你们原核表达的是上清还是包涵体蛋白？我要做的抗体确实是研究分子间相互作用的，我以前用这个蛋白的包涵体做抗原获得的抗体试过IP，发现这个抗体不能用于IP实验，所以这次想用可溶的蛋白做抗原再制备抗体来做。
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6楼2016-06-21 21:47:03
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
想要可溶性表达，就先不要考虑表达量高，实在需要的蛋白多，可以在获得可溶性表达的情况下多培养一点。反正你做抗体而已，要得不多。要提高可溶性表达，原核生物要选择弱启动子，不要选择T7，哪怕pUC载体上面的lac启动子都比T7容易得到可溶性的蛋白。选择低温培养，低浓度诱导剂诱导。必要的时候考虑与高可溶性蛋白标签融合表达，比如SUMO,GST,malE,nus等等。
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为什么
7楼2016-06-22 02:31:48
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 547star at 2016-06-22 02:31:48
想要可溶性表达，就先不要考虑表达量高，实在需要的蛋白多，可以在获得可溶性表达的情况下多培养一点。反正你做抗体而已，要得不多。要提高可溶性表达，原核生物要选择弱启动子，不要选择T7，哪怕pUC载体上面的lac启 ...

谢谢，我的表达量不高，上清中很少，我用的温度已经很低了（16度），我上次试过用我得到的上清蛋白去纯化，纯化完一透析或浓缩蛋白又沉淀了。
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8楼2016-06-22 07:58:57
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1192841993
10楼2016-07-21 15:04:36
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