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weizhi111至尊木虫 (正式写手)
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真核细胞高效表达蛋白的方法 已有2人参与
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| 有人知道真核细胞有没有高效表达蛋白的办法？我想提高蛋白表达量，一般真核表达只能达到Wetern blot检测的级别，但是我想要多表达一些蛋白，想要做免疫动物用的抗原（原核表达可溶性差，我想要可溶蛋白）。目前已知的SF9昆虫细胞系表达量较高，但是要转好几次质粒，还要转病毒，太繁琐，有没有相对简单一点的办法？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
weizhi111: 金币+4, ★★★很有帮助 2016-06-21 07:41:01
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weizhi111: 金币+4, ★★★很有帮助 2016-06-21 07:41:01
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您好，蛋白的话，看蛋白序列，如果能用原核做当然是最好的，根据我的经验，如果是制备抗原的话完全没有必要用真核细胞做 真的 我们做个好多蛋白（大于几百个了），基因优化表达条件优化纯化优化，做出来的蛋白作为抗原是肯定没有问题的，至于你说的可溶性，应该这样说，只要是重组蛋白都必须是可溶性的，但是是不是上清就不能混为一谈了，上清是指原核表达上清中获得的蛋白，简单来说就是上清一定是可溶性的，但可溶性不一定是来源于上清，有时候获得了包涵体，但是只要成功复性，去做抗原肯定是可以的，但是要作为其他的比如制药啊之类的对蛋白要求高的，就不行了， 另外真核的话，瞬时转染本身表达就低，但是东西好啊（好是好但是你不需要用这个的 真的）条件当然是很难优化的 我们也做过不少的哺乳动物细胞表达的蛋白也都成功了 但是成本太高 养细胞就不容易啊~ 真的 我们做过几千个蛋白了 制备蛋白作为抗原去打动物的 就有几百个 你的蛋白可溶性差完全就是你自己的实验没有优化到最优条件 记住 一定要从序列开始优化 密码子的简并性~ 以上都是真心话希望对你有所帮助~ |
3楼2016-06-20 16:24:04
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2楼2016-06-20 12:25:09
weizhi111
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4楼2016-06-21 07:49:14
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谢谢您真诚的回复~ 蛋白表达密码子优化肯定是非常非常重要的，根据密码子的简并性，同一个蛋白是对应三种密码子的（M起始密码子除外啊），所以不同的表达系统是有自己的密码子偏爱性的，举例酪氨酸对应4中密码子：CCU,CCC,CCA,CCG，无论密码子怎么不一样反正对应的蛋白是一样的都是酪氨酸，但是大肠杆菌系统可能只喜欢 CCA密码子不喜欢CCU呢，这样你就需要把CCU换成CCA去基因合成啊，就是想这个意思，可能不是正确的哈，另外除此之外，优化的还有mRNA结构优化，这些都是为了提高蛋白在上清中表达量的，，一般如果蛋白序列如果好优化的话，上清是能够得到的，还是看蛋白序列~还有你这个蛋白有没有人做过,你看看相关文献~ 包涵体复性，你试过比较难很正常，你也不是专业做蛋白的，复性需要掌握的火候太多，精准，没有足够的经验很难尝试成功的~ 你说的IP实验，是研究抗原抗体特异性结合的，是想要做分子间相互作用吗？ 我们刚刚做过这个实验，原核表达蛋白作为抗原和抗体反应检测相互作用，测亲和力什么的，是完全可以的。 |
5楼2016-06-21 10:25:51
