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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR一直跑不出来，排除了该排除的原因了还是跑不出来
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lanwang

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直跑不出来，排除了该排除的原因了还是跑不出来 已有7人参与

我最近在提取黑曲霉基因组DNA，克隆特定的葡萄糖氧化酶基因，但我的菌株是菌种保藏中心购买的标准菌株，不是克隆我需要的特定基因的特定菌株，我开始提的RNA，再反转录成CDNA跑PCR,退火温度跑的是55-65℃的梯度，用的10微升体系，没跑出来，后来又提的DNA,同样是跑的温度梯度，我需要的目的基因是1818bp，所以用的是高保真酶，引物也设计了好几对了，都是公司帮设计的，应该没问题，CDNA和DNA的浓度以及OD值都正常，但是不管用什么方法都跑不出来，求大神啊，真不知道该怎么办了，试验就卡在第一步了，好焦心呐！！！！！电泳图上除了marker就什么都没有了，有时候有引物二聚体
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1楼 2016-06-01 15:32:16
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-01 22:27:08
xn8008: 应助指数+1 2016-07-17 08:03:46
一般这种常见的基因没必要自己设计引物，搜索相关的文献均可以查找到设计好且条件成熟的引物，核对一下引物序列和扩增条件，没有问题就可以采用，我查找到的网站链接如下：http://www.docin.com/p-1350669733.html；
仅供楼主参考，以DNA为模板，建议反应体系加大到30ul，毕竟PCR扩增产物还是需要测序验证一下才行。
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6楼2016-06-01 22:07:46
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-01 22:26:54
你特定基因，在你的模板基因组DNA中是否存在？不同菌株可能存在差异，建议设计兼并引物试一下。
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2楼2016-06-01 15:34:52
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普通回帖

lanwang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2016-06-01 15:34:52
你特定基因，在你的模板基因组DNA中是否存在？不同菌株可能存在差异，建议设计兼并引物试一下。

我对比了不同菌株葡萄糖氧化酶基因的CDS序列，相似性达到了90％
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3楼2016-06-01 15:42:47
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lanwang at 2016-06-01 15:42:47
我对比了不同菌株葡萄糖氧化酶基因的CDS序列，相似性达到了90％...

一般来说，同源基因的CDS区相对保守，但是UTR区的variable就比较多。建议可以比对，往UTR区再看看。
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4楼2016-06-01 15:45:01
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lanwang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 晞朔 at 2016-06-01 15:45:01
一般来说，同源基因的CDS区相对保守，但是UTR区的variable就比较多。建议可以比对，往UTR区再看看。...

好的，谢谢！
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5楼2016-06-01 15:46:30
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lanwang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yesucao at 2016-06-01 22:07:46
一般这种常见的基因没必要自己设计引物，搜索相关的文献均可以查找到设计好且条件成熟的引物，核对一下引物序列和扩增条件，没有问题就可以采用，我查找到的网站链接如下：http://www.docin.com/p-1350669733.html； ...

非常感谢！我看的文章中都是用的含有特定葡萄糖氧化酶基因的菌株，所以提取其DNA再克隆就肯定没问题，我买的是菌种保藏中心的标准菌株，理应是没问题，但是就不能用人家文章上的引物了，而且文章里是根据其相似性很高的其他葡萄糖氧化酶基因的序列设计的引物，最终克隆出目的基因。
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7楼2016-06-02 10:20:29
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monkia


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8楼2016-06-02 11:46:47
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tangbowen

新虫 (小有名气)
有没有想过是，酶什么过期了

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9楼2016-06-02 11:57:02
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030Selma

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-04 22:07:21
先换酶试试，高保真也有不同品牌~或者先用非高保真的看能不能扩出来，还不能可能就是模板问题了

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10楼2016-06-02 12:20:11
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