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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR一直跑不出来，排除了该排除的原因了还是跑不出来
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lanwang

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直跑不出来，排除了该排除的原因了还是跑不出来 已有7人参与

我最近在提取黑曲霉基因组DNA，克隆特定的葡萄糖氧化酶基因，但我的菌株是菌种保藏中心购买的标准菌株，不是克隆我需要的特定基因的特定菌株，我开始提的RNA，再反转录成CDNA跑PCR,退火温度跑的是55-65℃的梯度，用的10微升体系，没跑出来，后来又提的DNA,同样是跑的温度梯度，我需要的目的基因是1818bp，所以用的是高保真酶，引物也设计了好几对了，都是公司帮设计的，应该没问题，CDNA和DNA的浓度以及OD值都正常，但是不管用什么方法都跑不出来，求大神啊，真不知道该怎么办了，试验就卡在第一步了，好焦心呐！！！！！电泳图上除了marker就什么都没有了，有时候有引物二聚体
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1楼 2016-06-01 15:32:16
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monkia


发自小木虫Android客户端
8楼2016-06-02 11:46:47
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-01 22:26:54
你特定基因，在你的模板基因组DNA中是否存在？不同菌株可能存在差异，建议设计兼并引物试一下。
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2楼2016-06-01 15:34:52
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lanwang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2016-06-01 15:34:52
你特定基因，在你的模板基因组DNA中是否存在？不同菌株可能存在差异，建议设计兼并引物试一下。

我对比了不同菌株葡萄糖氧化酶基因的CDS序列，相似性达到了90％
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3楼2016-06-01 15:42:47
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lanwang at 2016-06-01 15:42:47
我对比了不同菌株葡萄糖氧化酶基因的CDS序列，相似性达到了90％...

一般来说，同源基因的CDS区相对保守，但是UTR区的variable就比较多。建议可以比对，往UTR区再看看。
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4楼2016-06-01 15:45:01
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