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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒双酶切。
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒双酶切。 已有5人参与

提取的质粒，经过双酶切，目的片段是2781bp，载体的片段是2686bp经双酶切后，发现只有一条带，目的片段和载体都处于一个位置，怎么才能跑开两条带？紧急紧急
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1楼 2016-05-07 07:12:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
明显用3酶切，把载体上有的单一位点一起切了，载体被切切碎不就行了么
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3楼2016-05-07 10:37:32
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liuyuxue

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-07 18:46:30
你好，我的目的片段是2781bp,载体片段是2686bp，质粒双酶切后。跑电泳，结果显示就一条带，在2000-3000之间。...

你做完双酶切之后，再接着做个单酶切，把载体片段再切开，然后电泳就能分开了
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花落人亡两不知
8楼2016-05-07 21:09:47
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liuyuxue

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不行再做一次酶切，找个在载体片段上有酶切位点的
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花落人亡两不知
2楼2016-05-07 10:12:01
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原海亮

木虫 (著名写手)
你可以把你用的两个酶更换一下，可以分析构建好的质粒图谱，选两个酶切后片段差异较大的酶，只要可以验证克隆就好

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
7楼2016-05-07 19:05:14
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 16:21:18
我之前双酶切，切得是质粒，因为质粒的大小正好是目的片段的一半，这样进行双酶切之后，电泳跑胶分不开，所以现在打算直接对PCR回收纯化产物进行双酶切，双酶切后可不可以不跑胶，直接对双酶切后的体系进行纯化？...

如果pcr产物的话，回收后酶切可以直接纯化使用的

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
13楼2016-05-08 19:58:35
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青苹果QT

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换百分之二的胶，跑胶时间长一些试试。
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15楼2016-05-08 21:44:58
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轩辕漪

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
23楼2016-05-10 21:48:45
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普通回帖

yuan720222

新虫 (初入文坛)
你好，是对载体上的每一个酶切位点（除目的片段所包含的）都进行单酶切吗
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4楼2016-05-07 18:40:48
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-07 10:37:32
明显用3酶切，把载体上有的单一位点一起切了，载体被切切碎不就行了么

你好，是对载体上的每一个酶切位点（除目的片段所包含的）都进行单酶切吗
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5楼2016-05-07 18:43:53
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuyuxue at 2016-05-07 10:12:01
不行再做一次酶切，找个在载体片段上有酶切位点的

你好，我的目的片段是2781bp,载体片段是2686bp，质粒双酶切后。跑电泳，结果显示就一条带，在2000-3000之间。
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6楼2016-05-07 18:46:30
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-07 19:05:14
你可以把你用的两个酶更换一下，可以分析构建好的质粒图谱，选两个酶切后片段差异较大的酶，只要可以验证克隆就好

可不可以直接对回收产物进行双酶切，双酶切后产物在进行回收，在回收的过程中，蛋白会不会损失很多？
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9楼2016-05-08 07:39:22
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
9楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 07:39:22
可不可以直接对回收产物进行双酶切，双酶切后产物在进行回收，在回收的过程中，蛋白会不会损失很多？...

不明白你实验的目的是什么，你是要回收pcr产物进行酶切？还是要回收酶切下来的目的片段？

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
10楼2016-05-08 08:33:43
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