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yuan720222

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10楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 08:33:43
不明白你实验的目的是什么，你是要回收pcr产物进行酶切？还是要回收酶切下来的目的片段？
...

我之前双酶切，切得是质粒，因为质粒的大小正好是目的片段的一半，这样进行双酶切之后，电泳跑胶分不开，所以现在打算直接对PCR回收纯化产物进行双酶切，双酶切后可不可以不跑胶，直接对双酶切后的体系进行纯化？

11楼2016-05-08 16:21:18

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yuan720222

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10楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 08:33:43
不明白你实验的目的是什么，你是要回收pcr产物进行酶切？还是要回收酶切下来的目的片段？
...

我之前做的是质粒双酶切，因目的片段接近质粒片段的一半，进行双酶切后，电泳跑不开条带，所以现在选择直接对PCR回收产物进行双酶切，哪酶切后的体系不经过跑胶可以进行直接纯化吗？因为跑胶后，发现目的条带很暗，怕跑胶后会损失一部分，所以打算直接对酶切后的体系进行纯化，不知道可不可行

12楼2016-05-08 16:32:43

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原海亮

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【答案】应助回帖

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11楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 16:21:18
我之前双酶切，切得是质粒，因为质粒的大小正好是目的片段的一半，这样进行双酶切之后，电泳跑胶分不开，所以现在打算直接对PCR回收纯化产物进行双酶切，双酶切后可不可以不跑胶，直接对双酶切后的体系进行纯化？...

如果pcr产物的话，回收后酶切可以直接纯化使用的

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天空才是极限，我有信心飞的更高！

13楼2016-05-08 19:58:35

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yuan720222

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13楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 19:58:35
如果pcr产物的话，回收后酶切可以直接纯化使用的
...

但是有一点我不太清楚，是PCR扩增后，进行切胶回收，对回收产物进行双酶切吗？那双酶切之后还进行跑胶回收吗？

14楼2016-05-08 21:25:50

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青苹果QT

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感谢参与，应助指数 +1

换百分之二的胶，跑胶时间长一些试试。

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15楼2016-05-08 21:44:58

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15楼: Originally posted by 青苹果QT at 2016-05-08 21:44:58
换百分之二的胶，跑胶时间长一些试试。

我也有这个打算，谢谢

16楼2016-05-09 07:16:44

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kernim

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14楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 21:25:50
但是有一点我不太清楚，是PCR扩增后，进行切胶回收，对回收产物进行双酶切吗？那双酶切之后还进行跑胶回收吗？...

可以不跑胶，加binding直接回收过柱。

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17楼2016-05-09 07:27:30

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原海亮

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14楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 21:25:50
但是有一点我不太清楚，是PCR扩增后，进行切胶回收，对回收产物进行双酶切吗？那双酶切之后还进行跑胶回收吗？...

这个要看你pcr产物的特异性怎么样了，如果特异性非常好，可以不跑胶，做个过柱纯化除掉pcr体系成分再进行酶切，这样的酶切产物可以直接柱纯化。对于pcr特异性不好的产物还是要进行胶回收的

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18楼2016-05-09 11:17:19

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小飞飞XF

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我出现过这个情况，后面发现是我的霉过期了，你可以试试

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19楼2016-05-09 14:26:08

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飞翔的吉大人

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再做一个单酶切，可能连接位点失活，又或者酶有问题

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20楼2016-05-10 17:38:48

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