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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 08:33:43
不明白你实验的目的是什么,你是要回收pcr产物进行酶切?还是要回收酶切下来的目的片段?
...

我之前双酶切,切得是质粒,因为质粒的大小正好是目的片段的一半,这样进行双酶切之后,电泳跑胶分不开,所以现在打算直接对PCR回收纯化产物进行双酶切,双酶切后可不可以不跑胶,直接对双酶切后的体系进行纯化?
11楼2016-05-08 16:21:18
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 08:33:43
不明白你实验的目的是什么,你是要回收pcr产物进行酶切?还是要回收酶切下来的目的片段?
...

我之前做的是质粒双酶切,因目的片段接近质粒片段的一半,进行双酶切后,电泳跑不开条带,所以现在选择直接对PCR回收产物进行双酶切,哪酶切后的体系不经过跑胶可以进行直接纯化吗?因为跑胶后,发现目的条带很暗,怕跑胶后会损失一部分,所以打算直接对酶切后的体系进行纯化,不知道可不可行
12楼2016-05-08 16:32:43
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 16:21:18
我之前双酶切,切得是质粒,因为质粒的大小正好是目的片段的一半,这样进行双酶切之后,电泳跑胶分不开,所以现在打算直接对PCR回收纯化产物进行双酶切,双酶切后可不可以不跑胶,直接对双酶切后的体系进行纯化?...

如果pcr产物的话,回收后酶切可以直接纯化使用的

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
13楼2016-05-08 19:58:35
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-08 19:58:35
如果pcr产物的话,回收后酶切可以直接纯化使用的
...

但是有一点我不太清楚,是PCR扩增后,进行切胶回收,对回收产物进行双酶切吗?那双酶切之后还进行跑胶回收吗?
14楼2016-05-08 21:25:50
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青苹果QT

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换百分之二的胶,跑胶时间长一些试试。
15楼2016-05-08 21:44:58
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 青苹果QT at 2016-05-08 21:44:58
换百分之二的胶,跑胶时间长一些试试。

我也有这个打算,谢谢
16楼2016-05-09 07:16:44
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kernim

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
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14楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 21:25:50
但是有一点我不太清楚,是PCR扩增后,进行切胶回收,对回收产物进行双酶切吗?那双酶切之后还进行跑胶回收吗?...

可以不跑胶,加binding直接回收过柱。

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17楼2016-05-09 07:27:30
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by yuan720222 at 2016-05-08 21:25:50
但是有一点我不太清楚,是PCR扩增后,进行切胶回收,对回收产物进行双酶切吗?那双酶切之后还进行跑胶回收吗?...

这个要看你pcr产物的特异性怎么样了,如果特异性非常好,可以不跑胶,做个过柱纯化除掉pcr体系成分再进行酶切,这样的酶切产物可以直接柱纯化。对于pcr特异性不好的产物还是要进行胶回收的

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18楼2016-05-09 11:17:19
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小飞飞XF

金虫 (小有名气)

我出现过这个情况,后面发现是我的霉过期了,你可以试试

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19楼2016-05-09 14:26:08
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飞翔的吉大人

新虫 (初入文坛)

再做一个单酶切,可能连接位点失活,又或者酶有问题

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20楼2016-05-10 17:38:48
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