应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 双酶切切不开
191/2返回列表12下一页
查看: 1957  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

博克侬浮码

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切切不开 已有1人参与

做双酶切，用的NEB的Bgl II和Nsil ，两种酶都是同一种buffer3.1，但是为啥死活切不开，双酶切体系20ul与50ul的都试过了，实在找不出原因。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-05-05 17:08:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好
赞一下(2人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
2楼2016-05-05 18:24:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunguangchao

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-08 17:01:15
没掉下来目的片段，单酶切开始能切开，后来也切不开了...

如果是之前单酶切能切开，后来切不开了说明很大可能，你的酶活性降低了， 或者干脆失活了，建议你首先再次验证之前能切开的单酶切反应，然后够买新酶。 双酶切同时不work的时候建议分别进行单酶切。
赞一下(1人) 回复此楼
仍然自由自我，永远高唱我歌，走遍千里
15楼2016-05-10 05:22:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
16楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-10 18:15:15
质粒是其他实验室的师姐给的，用他的用两种酶分别单酶切能切开，双酶切切不开，我把他给的质粒转到细菌里，再提质粒，单酶切双酶切都切不开，难道是我提的质粒有问题？但是质粒已经提好多遍了还是切不开，愁死了， ...

1）如果你拿过来能切开，转大肠杆菌后再提质粒，切不开，问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响，也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点，她给你的质粒不纯，你提质粒的那个单菌落就是不对的。要质粒的同时要图谱是必须要做的事情。尤其是自己转化的这种，必须用多对酶切组合，证明质粒是对的。
2）没有在NEB的说明书上看到这两个酶有什么问题。你非要用的话，建议做两个实验（先证明你的质粒是对的）
其一，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，失活第一个酶，再加入第二个酶（直接加酶，因为Buffer一样），酶切完全的时间反应后，看结果。
其二，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，PCR纯化柱回收DNA后，重新加第二个酶的反应体系作反应。看结果。
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
17楼2016-05-10 23:11:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

娟恋幸福

新虫 (小有名气)
我用Bgl ll和SalI也是切不开，都快愁死了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-05-05 23:49:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shuimu911

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2016-05-05 23:57:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shuimu911

禁虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-05-10 08:52:57
本帖内容被屏蔽
5楼2016-05-05 23:58:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Cathering_w

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-05-10 08:52:27
分别确定，用一定能切开的酶和质粒分别验证到底是哪出的问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
博士终于毕业了，未来还有什么困难能难得倒我呢！加油我得未来。
6楼2016-05-06 11:23:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小威斯

铁虫 (小有名气)
1.到底是否存在这两个酶切位点  2.分步酶切试试

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-05-07 00:27:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kungfu2016

新虫 (正式写手)
先确定单酶是否有效

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
8楼2016-05-07 19:24:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Annabel0715

金虫 (小有名气)
多加点时间长点

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
9楼2016-05-07 21:10:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好

没掉下来目的片段，单酶切开始能切开，后来也切不开了
赞一下 回复此楼
10楼2016-05-08 17:01:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 博克侬浮码 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿 西北大学 总分282 英语一62 求调剂 +3 18419759900 2026-03-25 3/150 2026-03-25 23:20 by peike
[考研] 调剂310 +3 温柔的晚安 2026-03-25 4/200 2026-03-25 23:16 by peike
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 机械学硕总分317求调剂！！！！ +4 Acaciad 2026-03-25 4/200 2026-03-25 19:59 by hanserlol
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 材料277求调剂 +4 min3 2026-03-24 4/200 2026-03-25 15:29 by fch1983
[考研] 【2026考研调剂】制药工程 284分 求相关专业调剂名额 +4 袁奂奂 2026-03-25 8/400 2026-03-25 14:32 by lbsjt
[考研] 303求调剂 +6 元夕元 2026-03-20 7/350 2026-03-25 12:00 by edmund7
[考研] 07化学280分求调剂 +7 722865 2026-03-23 7/350 2026-03-25 09:29 by aa331100
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +6 @taotao 2026-03-19 6/300 2026-03-25 08:37 by 木托莫露露
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 306求0703调剂一志愿华中师范 +10 纸鱼ly 2026-03-21 11/550 2026-03-24 17:22 by qingfeng258
[考研] 材料292调剂 +8 橘颂思美人 2026-03-23 8/400 2026-03-24 16:33 by laoshidan
[考博] 申博26年 +4 八6八68 2026-03-19 4/200 2026-03-24 15:49 by 小Ben呵呵
[考研] 一志愿北京化工大学材料与化工 264分各科过A区国家线 +3 哈哈157349 2026-03-21 3/150 2026-03-24 14:11 by zhyzzh
[考研] 291求调剂 +8 hhhhxn.. 2026-03-23 8/400 2026-03-23 23:15 by peike
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境，总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-23 8/400 2026-03-23 20:36 by Creta
[考研] 336化工调剂 +4 王大坦1 2026-03-23 5/250 2026-03-23 18:32 by allen-yin
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭