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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 双酶切切不开
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切切不开 已有1人参与

做双酶切，用的NEB的Bgl II和Nsil ，两种酶都是同一种buffer3.1，但是为啥死活切不开，双酶切体系20ul与50ul的都试过了，实在找不出原因。
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1楼 2016-05-05 17:08:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好
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Let God do with it as He wills
2楼2016-05-05 18:24:22
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sunguangchao

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-08 17:01:15
没掉下来目的片段，单酶切开始能切开，后来也切不开了...

如果是之前单酶切能切开，后来切不开了说明很大可能，你的酶活性降低了， 或者干脆失活了，建议你首先再次验证之前能切开的单酶切反应，然后够买新酶。 双酶切同时不work的时候建议分别进行单酶切。
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仍然自由自我，永远高唱我歌，走遍千里
15楼2016-05-10 05:22:03
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
16楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-10 18:15:15
质粒是其他实验室的师姐给的，用他的用两种酶分别单酶切能切开，双酶切切不开，我把他给的质粒转到细菌里，再提质粒，单酶切双酶切都切不开，难道是我提的质粒有问题？但是质粒已经提好多遍了还是切不开，愁死了， ...

1）如果你拿过来能切开，转大肠杆菌后再提质粒，切不开，问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响，也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点，她给你的质粒不纯，你提质粒的那个单菌落就是不对的。要质粒的同时要图谱是必须要做的事情。尤其是自己转化的这种，必须用多对酶切组合，证明质粒是对的。
2）没有在NEB的说明书上看到这两个酶有什么问题。你非要用的话，建议做两个实验（先证明你的质粒是对的）
其一，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，失活第一个酶，再加入第二个酶（直接加酶，因为Buffer一样），酶切完全的时间反应后，看结果。
其二，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，PCR纯化柱回收DNA后，重新加第二个酶的反应体系作反应。看结果。
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Let God do with it as He wills
17楼2016-05-10 23:11:01
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普通回帖

娟恋幸福

新虫 (小有名气)
我用Bgl ll和SalI也是切不开，都快愁死了

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3楼2016-05-05 23:49:30
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shuimu911

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2016-05-05 23:57:16
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shuimu911

禁虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-05-10 08:52:57
本帖内容被屏蔽
5楼2016-05-05 23:58:27
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Cathering_w

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-05-10 08:52:27
分别确定，用一定能切开的酶和质粒分别验证到底是哪出的问题

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博士终于毕业了，未来还有什么困难能难得倒我呢！加油我得未来。
6楼2016-05-06 11:23:45
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小威斯

铁虫 (小有名气)
1.到底是否存在这两个酶切位点  2.分步酶切试试

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7楼2016-05-07 00:27:11
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kungfu2016

新虫 (正式写手)
先确定单酶是否有效

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8楼2016-05-07 19:24:13
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Annabel0715

金虫 (小有名气)
多加点时间长点

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9楼2016-05-07 21:10:03
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好

没掉下来目的片段，单酶切开始能切开，后来也切不开了
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10楼2016-05-08 17:01:15
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