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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 娟恋幸福 at 2016-05-05 23:49:30
我用Bgl ll和SalI也是切不开,都快愁死了

哎,做酶切从来没那么愁过
11楼2016-05-08 17:01:56
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

内容已删除
12楼2016-05-08 17:03:39
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shuimu911

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

13楼2016-05-09 00:56:56
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砍人

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你确定是不是buffer过期了。
努力努力努力
14楼2016-05-09 18:49:47
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sunguangchao

银虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-08 17:01:15
没掉下来目的片段,单酶切开始能切开,后来也切不开了...

如果是之前单酶切能切开,后来切不开了说明很大可能,你的酶活性降低了, 或者干脆失活了,建议你首先再次验证之前能切开的单酶切反应,然后够买新酶。 双酶切同时不work的时候建议分别进行单酶切。
仍然自由自我,永远高唱我歌,走遍千里
15楼2016-05-10 05:22:03
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1)怎么确定切不开?是没有掉下来目的片段还是啥情况呢?
2)切不开就分步单酶切
3)是做酶切连接吗?是的话,这对酶选的真不好

质粒是其他实验室的师姐给的,用他的用两种酶分别单酶切能切开,双酶切切不开,我把他给的质粒转到细菌里,再提质粒,单酶切双酶切都切不开,难道是我提的质粒有问题?但是质粒已经提好多遍了还是切不开,愁死了,中提,小提都试过了
16楼2016-05-10 18:15:15
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

引用回帖:
16楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-10 18:15:15
质粒是其他实验室的师姐给的,用他的用两种酶分别单酶切能切开,双酶切切不开,我把他给的质粒转到细菌里,再提质粒,单酶切双酶切都切不开,难道是我提的质粒有问题?但是质粒已经提好多遍了还是切不开,愁死了, ...

1)如果你拿过来能切开,转大肠杆菌后再提质粒,切不开,问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响,也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点,她给你的质粒不纯,你提质粒的那个单菌落就是不对的。要质粒的同时要图谱是必须要做的事情。尤其是自己转化的这种,必须用多对酶切组合,证明质粒是对的。
2)没有在NEB的说明书上看到这两个酶有什么问题。你非要用的话,建议做两个实验(先证明你的质粒是对的)
其一,先加入一个酶酶切后,保证酶切完全的时间即可,失活第一个酶,再加入第二个酶(直接加酶,因为Buffer一样),酶切完全的时间反应后,看结果。
其二,先加入一个酶酶切后,保证酶切完全的时间即可,PCR纯化柱回收DNA后,重新加第二个酶的反应体系作反应。看结果。
Let God do with it as He wills
17楼2016-05-10 23:11:01
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-10 23:11:01
1)如果你拿过来能切开,转大肠杆菌后再提质粒,切不开,问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响,也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点,她给你的质粒不纯,你提质粒的那个单菌落就是不 ...

太感谢了,准备试试,希望会有好结果
18楼2016-05-11 12:19:18
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1)怎么确定切不开?是没有掉下来目的片段还是啥情况呢?
2)切不开就分步单酶切
3)是做酶切连接吗?是的话,这对酶选的真不好

你好,我想问问如何要怎么样选取酶才算好?
19楼2016-05-23 09:03:59
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