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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 双酶切切不开
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 娟恋幸福 at 2016-05-05 23:49:30
我用Bgl ll和SalI也是切不开，都快愁死了

哎，做酶切从来没那么愁过
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11楼2016-05-08 17:01:56
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
内容已删除
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12楼2016-05-08 17:03:39
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shuimu911

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
13楼2016-05-09 00:56:56
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砍人

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你确定是不是buffer过期了。
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努力努力努力
14楼2016-05-09 18:49:47
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sunguangchao

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-08 17:01:15
没掉下来目的片段，单酶切开始能切开，后来也切不开了...

如果是之前单酶切能切开，后来切不开了说明很大可能，你的酶活性降低了， 或者干脆失活了，建议你首先再次验证之前能切开的单酶切反应，然后够买新酶。 双酶切同时不work的时候建议分别进行单酶切。
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仍然自由自我，永远高唱我歌，走遍千里
15楼2016-05-10 05:22:03
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好

质粒是其他实验室的师姐给的，用他的用两种酶分别单酶切能切开，双酶切切不开，我把他给的质粒转到细菌里，再提质粒，单酶切双酶切都切不开，难道是我提的质粒有问题？但是质粒已经提好多遍了还是切不开，愁死了，中提，小提都试过了
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16楼2016-05-10 18:15:15
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
16楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-10 18:15:15
质粒是其他实验室的师姐给的，用他的用两种酶分别单酶切能切开，双酶切切不开，我把他给的质粒转到细菌里，再提质粒，单酶切双酶切都切不开，难道是我提的质粒有问题？但是质粒已经提好多遍了还是切不开，愁死了， ...

1）如果你拿过来能切开，转大肠杆菌后再提质粒，切不开，问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响，也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点，她给你的质粒不纯，你提质粒的那个单菌落就是不对的。要质粒的同时要图谱是必须要做的事情。尤其是自己转化的这种，必须用多对酶切组合，证明质粒是对的。
2）没有在NEB的说明书上看到这两个酶有什么问题。你非要用的话，建议做两个实验（先证明你的质粒是对的）
其一，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，失活第一个酶，再加入第二个酶（直接加酶，因为Buffer一样），酶切完全的时间反应后，看结果。
其二，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，PCR纯化柱回收DNA后，重新加第二个酶的反应体系作反应。看结果。
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Let God do with it as He wills
17楼2016-05-10 23:11:01
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-10 23:11:01
1）如果你拿过来能切开，转大肠杆菌后再提质粒，切不开，问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响，也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点，她给你的质粒不纯，你提质粒的那个单菌落就是不 ...

太感谢了，准备试试，希望会有好结果
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18楼2016-05-11 12:19:18
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:24:22
1）怎么确定切不开？是没有掉下来目的片段还是啥情况呢？
2）切不开就分步单酶切
3）是做酶切连接吗？是的话，这对酶选的真不好

你好，我想问问如何要怎么样选取酶才算好？
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19楼2016-05-23 09:03:59
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