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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

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[求助] 双酶切切不开已有1人参与

做双酶切，用的NEB的Bgl II和Nsil ，两种酶都是同一种buffer3.1，但是为啥死活切不开，双酶切体系20ul与50ul的都试过了，实在找不出原因。

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1楼 2016-05-05 17:08:42

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atlanticwi

金虫 (正式写手)

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引用回帖:

16楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2016-05-10 18:15:15
质粒是其他实验室的师姐给的，用他的用两种酶分别单酶切能切开，双酶切切不开，我把他给的质粒转到细菌里，再提质粒，单酶切双酶切都切不开，难道是我提的质粒有问题？但是质粒已经提好多遍了还是切不开，愁死了， ...

1）如果你拿过来能切开，转大肠杆菌后再提质粒，切不开，问题肯定在你这边。两种酶不存在甲基化影响，也就是你转什么类型的宿主大肠杆菌应该都没问题。所以只有一点，她给你的质粒不纯，你提质粒的那个单菌落就是不对的。要质粒的同时要图谱是必须要做的事情。尤其是自己转化的这种，必须用多对酶切组合，证明质粒是对的。
2）没有在NEB的说明书上看到这两个酶有什么问题。你非要用的话，建议做两个实验（先证明你的质粒是对的）
其一，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，失活第一个酶，再加入第二个酶（直接加酶，因为Buffer一样），酶切完全的时间反应后，看结果。
其二，先加入一个酶酶切后，保证酶切完全的时间即可，PCR纯化柱回收DNA后，重新加第二个酶的反应体系作反应。看结果。