应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事
101/1返回列表
查看: 3061  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小小八八

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事 已有2人参与

用的是SacI+SmaI两个酶，单酶切试过了，酶没有问题，但是双酶切切出的T载骨架亮度正常，而我的目的条带几乎看不见，大小在800bp左右，怎么回事？我是想把我这个目的片段从T载体上切下来再克隆到其他载体上，除了先把母的片段连到T载体再从T载体上切下来，还有什么比较好的成功率比较高的方法吗？现在外面载体合成价格怎么算？

急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事
FA587493FBDE6721F8F377BA87219F75.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-03-30 09:30:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sihaiming

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小小八八: 金币+2 2016-03-30 09:50:11
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查
赞一下 回复此楼
2楼2016-03-30 09:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sihaiming at 2016-03-30 09:37:39
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查

嗯，谢谢，那p出来的基因都不用进行酶切，切胶回收再连接了吗？
赞一下 回复此楼
3楼2016-03-30 09:50:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sihaiming at 2016-03-30 09:37:39
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查

可是我的载体片段序列不知道
赞一下 回复此楼
4楼2016-03-30 09:58:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用其他方法，那就直接pcr扩增出来后，酶切直接连接你的载体，跳过T载体这一步，祝好。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-03-30 12:29:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:29:54
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用 ...

嗯，谢谢建议，T载体连接验证过了，是有目的条带的，不过浓度很低，肯定收不回来，我现在也准备直接pcr扩增再酶切连接看看了
赞一下 回复此楼
6楼2016-03-30 13:58:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
DNA LADDER没标大小，如果下边弱带是目的基因片段的话，这个亮度可以回收，多切些载体，多切两个胶会好些

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-03-31 08:13:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wj2423311236

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:29:54
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用 ...

直接酶切pcr产物的话引物上不是要加保护碱基吗？那还要重新设计引物

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
8楼2016-03-31 10:38:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

本帖仅楼主可见
赞一下
9楼2016-04-01 18:50:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

原来，是这样

金虫 (小有名气)
你这个t载体完全是空载啊，才两千多，t载体有很多种，大概都在两千七左右，和你电泳结果差不多。你重新做一下TA克隆，然后做转化蓝白斑筛选再提质粒酶切。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2016-04-02 23:08:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小小八八 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +9 archvillain 2026-08-02 11/550 2026-08-02 15:44 by alexon
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 8/400 2026-08-02 15:01 by jHcrHMhbKCFV
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 14/700 2026-08-02 14:58 by jHcrHMhbKCFV
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 18/900 2026-08-02 14:52 by jHcrHMhbKCFV
[找工作] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 12/600 2026-08-02 13:43 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +17 低垂的野花 2026-07-31 23/1150 2026-08-02 13:41 by RRRKKK
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 16/800 2026-08-02 13:34 by jHcrHMhbKCFV
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 14/700 2026-08-02 13:34 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +15 布布和一二 2026-07-30 21/1050 2026-08-02 10:56 by iaeyuan
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +8 锦衣卫寒战 2026-07-28 10/500 2026-08-02 10:00 by 锦衣卫寒战
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 7/350 2026-08-02 07:59 by 88817753
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +14 wangze12014 2026-07-28 18/900 2026-07-31 18:35 by lzchaihuo
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +11 winnerche 2026-07-29 15/750 2026-07-30 23:08 by jnhyjjm
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
[有机交流] 产物和副产物价值比较 30+4 小汤02 2026-07-27 5/250 2026-07-30 12:44 by czyzsu
[基金申请] 这种情况还有戏吗 +5 drbart 2026-07-27 11/550 2026-07-29 05:50 by drbart
[基金申请] 同事接到电话了，我却没有 +4 1234567wang 2026-07-27 4/200 2026-07-28 10:11 by GOODLUCKER
[基金申请] 准备明年的基金了 +5 Tide man 2026-07-27 5/250 2026-07-28 09:25 by newfuzzy1
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭