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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事
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小小八八

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事 已有2人参与

用的是SacI+SmaI两个酶，单酶切试过了，酶没有问题，但是双酶切切出的T载骨架亮度正常，而我的目的条带几乎看不见，大小在800bp左右，怎么回事？我是想把我这个目的片段从T载体上切下来再克隆到其他载体上，除了先把母的片段连到T载体再从T载体上切下来，还有什么比较好的成功率比较高的方法吗？现在外面载体合成价格怎么算？

急，双酶切切T载体和目的片段，结果目的片段切出来几乎看不到条带，怎么回事
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1楼 2016-03-30 09:30:53
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sihaiming

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小小八八: 金币+2 2016-03-30 09:50:11
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查
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2楼2016-03-30 09:37:39
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sihaiming at 2016-03-30 09:37:39
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查

嗯，谢谢，那p出来的基因都不用进行酶切，切胶回收再连接了吗？
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3楼2016-03-30 09:50:04
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sihaiming at 2016-03-30 09:37:39
你可以不用连到T载上，太麻烦，直接用一步克隆法，将基因片段P出来，按照试剂盒说明书，直接连到表达载体上。片段不用切，只需切你的载体就可以连接了。简单，效率高。一步克隆试剂盒很多公司可以买，你网上查查

可是我的载体片段序列不知道
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4楼2016-03-30 09:58:05
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用其他方法，那就直接pcr扩增出来后，酶切直接连接你的载体，跳过T载体这一步，祝好。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-03-30 12:29:54
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:29:54
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用 ...

嗯，谢谢建议，T载体连接验证过了，是有目的条带的，不过浓度很低，肯定收不回来，我现在也准备直接pcr扩增再酶切连接看看了
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6楼2016-03-30 13:58:17
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
DNA LADDER没标大小，如果下边弱带是目的基因片段的话，这个亮度可以回收，多切些载体，多切两个胶会好些

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7楼2016-03-31 08:13:06
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:29:54
首先，你这个T载体连接基因的克隆，验证是正确的么？会不会本身就没有连接上目的条带呢？其次，你的图确实质量不高，对焦不准确，看不大清楚，是有目的条带，但是浓度不高？还是压根就没有目的条带？最后，如果想用 ...

直接酶切pcr产物的话引物上不是要加保护碱基吗？那还要重新设计引物

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8楼2016-03-31 10:38:15
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匿名

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9楼2016-04-01 18:50:10
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
你这个t载体完全是空载啊，才两千多，t载体有很多种，大概都在两千七左右，和你电泳结果差不多。你重新做一下TA克隆，然后做转化蓝白斑筛选再提质粒酶切。

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10楼2016-04-02 23:08:35
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