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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 想问下做完酶切连接转化后为什么菌斑长不出来？
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小9999

新虫 (初入文坛)

[求助] 想问下做完酶切连接转化后为什么菌斑长不出来？ 已有3人参与

想问下做完酶切，与pet30质粒连接16度过夜的目的基因，转化后涂平板，为什么12小时后长出来的菌斑是透明的，而且很少，几乎没有？应该不是操作问题，做了好几遍，几个人同时做的，几乎都是这样。

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1楼 2016-03-29 11:42:38
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五蕴空

新虫 (初入文坛)
可能是感受态细胞没保存好，死了

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2楼2016-03-29 12:42:01
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小9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 五蕴空 at 2016-03-29 12:42:01
可能是感受态细胞没保存好，死了

买的感受态，保存在负80度的冰箱的，在冰盒里融化的。应该细胞没问题吧。

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3楼2016-03-29 12:58:24
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yzc937168

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没连接上？测序看看。或者抗性不对？抗生素浓度太高？
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吼吼吼～
4楼2016-03-29 15:07:18
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小9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-03-29 15:07:18
没连接上？测序看看。或者抗性不对？抗生素浓度太高？

16度连接过夜了，连上了，别人用一样的加抗生素kana固体培养基长出来很多菌斑，不是抗生素和连接的问题，会不会是表达载体选的不对？想问下pet30适合什么样的基因？

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5楼2016-03-29 18:03:18
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yzc937168

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

用pet30应该问题不大，抗性也对。你试试多用些感受态，提高连接产物浓度，转化离心后稍微多留些液体重悬试试。
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吼吼吼～
6楼2016-03-29 18:14:51
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小9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-03-29 18:14:51
用pet30应该问题不大，抗性也对。你试试多用些感受态，提高连接产物浓度，转化离心后稍微多留些液体重悬试试。

嗯，我试试，请问一般离心转速和时间多少才不会造成感受态细胞的破坏？

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7楼2016-03-29 20:21:26
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个结果应该和你片段载体酶切处理有关系吧，连接没问题，但是酶切效果不好的片段，照样会效率低

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
8楼2016-03-30 12:18:24
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by 小9999 at 2016-03-29 20:21:26
嗯，我试试，请问一般离心转速和时间多少才不会造成感受态细胞的破坏？
...

培养45分钟后的菌液，可以用4000rpm离心1min，弃部分上清，重悬，涂板
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9楼2016-03-30 17:13:26
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小9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:18:24
这个结果应该和你片段载体酶切处理有关系吧，连接没问题，但是酶切效果不好的片段，照样会效率低

酶切后电泳了，大小没错，而且可以看到有目的条带，就是目的基因的浓度有点小，这次我把连接体系改了看能否有菌长出来。

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10楼2016-03-31 16:17:31
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