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小9999

新虫 (初入文坛)

[求助] 想问下做完酶切连接转化后为什么菌斑长不出来? 已有3人参与

想问下做完酶切,与pet30质粒连接16度过夜的目的基因,转化后涂平板,为什么12小时后长出来的菌斑是透明的,而且很少,几乎没有?应该不是操作问题,做了好几遍,几个人同时做的,几乎都是这样。

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五蕴空

新虫 (初入文坛)

可能是感受态细胞没保存好,死了

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2楼2016-03-29 12:42:01
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小9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 五蕴空 at 2016-03-29 12:42:01
可能是感受态细胞没保存好,死了

买的感受态,保存在负80度的冰箱的,在冰盒里融化的。应该细胞没问题吧。

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3楼2016-03-29 12:58:24
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yzc937168

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没连接上?测序看看。或者抗性不对?抗生素浓度太高?
吼吼吼~
4楼2016-03-29 15:07:18
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小9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-03-29 15:07:18
没连接上?测序看看。或者抗性不对?抗生素浓度太高?

16度连接过夜了,连上了,别人用一样的加抗生素kana固体培养基长出来很多菌斑,不是抗生素和连接的问题,会不会是表达载体选的不对?想问下pet30适合什么样的基因?

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5楼2016-03-29 18:03:18
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yzc937168

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

用pet30应该问题不大,抗性也对。你试试多用些感受态,提高连接产物浓度,转化离心后稍微多留些液体重悬试试。
吼吼吼~
6楼2016-03-29 18:14:51
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小9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-03-29 18:14:51
用pet30应该问题不大,抗性也对。你试试多用些感受态,提高连接产物浓度,转化离心后稍微多留些液体重悬试试。

嗯,我试试,请问一般离心转速和时间多少才不会造成感受态细胞的破坏?

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7楼2016-03-29 20:21:26
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个结果应该和你片段载体酶切处理有关系吧,连接没问题,但是酶切效果不好的片段,照样会效率低

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
8楼2016-03-30 12:18:24
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 小9999 at 2016-03-29 20:21:26
嗯,我试试,请问一般离心转速和时间多少才不会造成感受态细胞的破坏?
...

培养45分钟后的菌液,可以用4000rpm离心1min,弃部分上清,重悬,涂板
9楼2016-03-30 17:13:26
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小9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-30 12:18:24
这个结果应该和你片段载体酶切处理有关系吧,连接没问题,但是酶切效果不好的片段,照样会效率低

酶切后电泳了,大小没错,而且可以看到有目的条带,就是目的基因的浓度有点小,这次我把连接体系改了看能否有菌长出来。

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10楼2016-03-31 16:17:31
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