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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！
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若无敌12138

银虫 (正式写手)

[求助] CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！ 已有2人参与

最近在做基因表达，扩CDS全长, 片段900左右，从CDS序列头尾上设计的引物，用基因组不保险，所以用的Q5高保真酶扩的cDNA，但条带一直都一直不是很亮，RNA反转录成cDNA这一步没问题，都测过浓度的，并且cDNA稀释了50倍扩的。后面要做片段融合，试过切胶回收，PCR产物直接回收浓度都非常低，没法做下一步，怎么破？CDS的GC含量不高，51%，引物Tm值相差大概3度，GC没问题，见下图左边较暗的4条带

1.确定cDNA没问题
2.酶没问题
3.引物的话，是头尾确定的吧

如果是体系的话，退火温度已经调到很低了，从65,63,60都试过，条带也不亮，切胶基本没有，AXYGEN、QUIGEN的都用过，不纯化吧，对后续实验可能会有影响，有人碰到类似的情况吗？？

CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！
P60321-222820.jpg
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1楼 2016-03-23 11:16:52
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zhijiangli

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 若无敌12138 at 2016-03-23 12:57:28
PCR产物为模板的话，是不是也得稀释一下？？那里面杂质会有影响吗？...

我是直接用的pcr产物 ，因为模板就很模糊，所以浓度不高，直接用就行。如果pcr产物浓度高的话最好稀释一下。
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缘分这东西O(∩_∩)O~
6楼2016-03-23 13:10:19
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3, ★有帮助 2016-03-23 12:57:54
增加下模板浓度，稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序
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2楼2016-03-23 11:31:04
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普通回帖

zhijiangli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3 2016-03-23 12:58:06
用pcr产物为模板扩增，循环数降低10-15个。试试
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缘分这东西O(∩_∩)O~
3楼2016-03-23 11:38:14
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若无敌12138

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-23 11:31:04
增加下模板浓度，稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序

谢谢建议，最先用的就是touchdown，从65,63到62 30s，从62,60到58 30s也试过，总共30个循环，更暗，后来一次性退火，还亮一点点，并不是非特异性扩增的问题
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4楼2016-03-23 12:56:09
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若无敌12138

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhijiangli at 2016-03-23 11:38:14
用pcr产物为模板扩增，循环数降低10-15个。试试

PCR产物为模板的话，是不是也得稀释一下？？那里面杂质会有影响吗？
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5楼2016-03-23 12:57:28
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mlxmiao

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 若无敌12138 at 2016-03-23 12:57:28
PCR产物为模板的话，是不是也得稀释一下？？那里面杂质会有影响吗？...

胶回收产物当模板哪？

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7楼2016-03-24 18:49:32
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maixiaodaou

新虫 (小有名气)
模板浓度可能有些低，或许是该基因的表达量低，同等浓度的模板，不同基因做PCR最终量不同，电泳条带亮度不同

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8楼2016-03-25 00:30:09
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geneyhh

金虫 (正式写手)
我遇到这种情况会最三管pcr，共150ul，然后一起回收，得到的会多一些目的产物，不影响后面的连接。

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9楼2016-03-25 17:34:07
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若无敌12138

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by geneyhh at 2016-03-25 17:34:07
我遇到这种情况会最三管pcr，共150ul，然后一起回收，得到的会多一些目的产物，不影响后面的连接。

谢谢，已经做出来了，二次PCR的
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10楼2016-03-25 18:36:56
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