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CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！ 已有2人参与
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最近在做基因表达，扩CDS全长, 片段900左右，从CDS序列头尾上设计的引物，用基因组不保险，所以用的Q5高保真酶扩的cDNA，但条带一直都一直不是很亮，RNA反转录成cDNA这一步没问题，都测过浓度的，并且cDNA稀释了50倍扩的。后面要做片段融合，试过切胶回收，PCR产物直接回收浓度都非常低，没法做下一步，怎么破？CDS的GC含量不高，51%，引物Tm值相差大概3度，GC没问题，见下图左边较暗的4条带 1.确定cDNA没问题 2.酶没问题 3.引物的话，是头尾确定的吧 如果是体系的话，退火温度已经调到很低了，从65,63,60都试过，条带也不亮，切胶基本没有，AXYGEN、QUIGEN的都用过，不纯化吧，对后续实验可能会有影响，有人碰到类似的情况吗？？  P60321-222820.jpg |
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zhijiangli
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