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i760912798

木虫 (正式写手)

[交流] 高保真酶扩增产物末端加A 已有3人参与

请问高保真酶扩增产物末端加A具体步骤是什么?
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wh-joseph

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-14 08:33:06
以pcr回收产物为模板,加入一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP或dNTP72℃,十分钟,然后将加A产物直接用于TA连接

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2楼2016-03-12 21:35:34
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i760912798

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wh-joseph at 2016-03-12 21:35:34
以pcr回收产物为模板,加入一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP或dNTP72℃,十分钟,然后将加A产物直接用于TA连接

高保真酶扩增的pcr产物加A后,还需要纯化吗?如果不纯化dNTP会影响连接吗?

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3楼2016-03-13 07:29:57
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poog502

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
有加a试剂盒,便宜

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4楼2016-03-13 08:06:12
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poog502

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 07:29:57
高保真酶扩增的pcr产物加A后,还需要纯化吗?如果不纯化dNTP会影响连接吗?
...

无需纯化,直接克隆。

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5楼2016-03-13 08:07:38
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i760912798

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by poog502 at 2016-03-13 08:07:38
无需纯化,直接克隆。
...

我是用普通taq酶mix,与等量的pcr产物混合进行加A,不需要纯化加A产物吗?

发自小木虫Android客户端
6楼2016-03-13 08:13:31
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tmac8410

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
为什么要加A呢?可以试试clonesmarter 的TOPO blunt end cloning kit

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分子生物学10年工作经验
7楼2016-03-13 08:52:34
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poog502

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 08:13:31
我是用普通taq酶mix,与等量的pcr产物混合进行加A,不需要纯化加A产物吗?
...

无需纯化,连接载体后做菌落PCR,挑阳性克隆测序
8楼2016-03-14 08:32:28
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