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苍蝇小田七

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 切胶回收纯化的DNA浓度太低不能用于连接载体，请教如何提高DNA浓度已有3人参与

从头说起是这样的，我是使用试剂盒提的核酸，提取后电泳没有条带。后来我用特异性引物进行了扩增，扩增结果不错，条带单一，位置大体也对，但是亮度一般。由于我的核酸不多，现在也就是还有30ul，而每次扩增模板量要2ul，所以今天上午我就把模板稀释了一下，用这个稀释的DNA又进行了扩增，准备回收纯化其中的DNA。可是PCR后电泳的结果不好，比较不亮，但是我坚持进行了切胶回收纯化，使用的是宝生物的盒子，回收后又电泳了一次，这次条带的亮度也就是能刚刚看到的样子，我自己知道这个浓度是不能做往下做连接的。求大神不吝赐教！另外还是有个问题，我发现回收后的条带位置比我PCR扩增的条带的位置更靠上了，这是怎么回事？今天没能拷出来电泳图，如果需要我后续补充。谢谢各位了！！！！

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1楼2016-02-27 20:44:59

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原海亮

木虫 (著名写手)

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如果使用了和聚合酶一致的条件，从你可以获得单一目的条带来看，扩增条件再优化对目的条带的浓度影响应该不大，可以适当增加循环数来提高目的条带浓度，这是最笨又最简单的方法。另外pcr模板还是不要稀释了，应该很容易得到的，你要是30微升用完了还搞不定那就肯定有问题了。最后，我偷偷告诉楼主，日常实验中，经常回收后压根就看不到目的条带，但是照样可以进行转化而且拿到了正确克隆，所以对于你这样还可以看到目的条带的（不知道回收完是不是还要进行酶切，如果需要，建议不要回收，直接pcr产物酶切，然后再回收，避免多次回收损失），我建议可以继续进行克隆，只是连接体系适当加大，比如20微升，目的是让你可以尽量多的加入目的条带，这样挑到几个转化子还是可以的，祝好！

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