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更恋秋风铁杆木虫 (小有名气)
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Gibson Assembly 一直做不出来,好伤心 已有2人参与
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我的片段大小: 片段1:6823bp 片段2:499bp 片段3:400bp 片段浓度: 片段1:112.5ng/ul 片段2:126.2ng/ul 片段3:113.3ng/ul 我的mix之前用的NEB mix ,今天又重新配了一次。 之前的体系 片段1:6ul 片段2:0.35ul 片段3:0.35ul mix:6.65ul 50度1小时。 不行。 今天我做了一个体系: 片段1:2ul 片段2:1.2ul 片段3:1.2ul mix:4.4ul 和 片段1:1.5ul 片段2:1.8ul 片段3:1.8ul mix:5.1ul 还有一个 片段1:1.5ul 片段2:1.8ul 片段3:1.8ul mix:5.1ul ddH2O:4.9ul 请大神帮忙看看 |
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redking2012
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9楼2016-02-27 23:00:48
【答案】应助回帖
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感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-27 16:43:05
更恋秋风: 金币+35, ★★★很有帮助, 感谢层主,有用,我正在试试先连上小的,后加大的。 2016-02-27 21:04:28
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| 我最近刚做了一个IN-FUSION跟你的差不多原理,我把我的经验告诉你一下,三个片段同时连接效率很低的,我是把三个片段同时插入到质粒中,片段大小分别是:2.3kb, 1kb, 700bp。我挑了40个班,大约一半的克隆能连进2.3kb的大片段,只有1个克隆三个片段同时插入的。推荐你用高保真酶来扩增你的片段。我们用的NEBQ5 high fidelity, 非常的不错,测序之后没有一个突变。 我看到你有一个6.8kb, 这样效率会很小的,,所以建议你先把大的插进去,在解决那两个小的。别瞎折腾了,这些同时插入的盒子没有说的那么牛,遇到大片段的时候,效率会很低的,建议分布做,这些是个人经验之谈, |
6楼2016-02-27 12:42:21
更恋秋风
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2楼2016-02-27 09:24:16
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3楼2016-02-27 09:24:29
4楼2016-02-27 10:31:55
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5楼2016-02-27 11:10:36
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7楼2016-02-27 21:03:36
fudan671
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8楼2016-02-27 21:37:53
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10楼2016-02-28 11:58:36














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