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更恋秋风铁杆木虫 (小有名气)
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Gibson Assembly 一直做不出来，好伤心已有2人参与
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我的片段大小： 片段1：6823bp 片段2：499bp 片段3:400bp 片段浓度： 片段1：112.5ng/ul 片段2：126.2ng/ul 片段3:113.3ng/ul 我的mix之前用的NEB mix ，今天又重新配了一次。 之前的体系 片段1：6ul 片段2：0.35ul 片段3:0.35ul mix：6.65ul 50度1小时。 不行。 今天我做了一个体系： 片段1：2ul 片段2：1.2ul 片段3:1.2ul mix：4.4ul 和 片段1：1.5ul 片段2：1.8ul 片段3:1.8ul mix：5.1ul 还有一个 片段1：1.5ul 片段2：1.8ul 片段3:1.8ul mix：5.1ul ddH2O：4.9ul 请大神帮忙看看 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-27 16:43:05
更恋秋风: 金币+35, ★★★很有帮助, 感谢层主，有用，我正在试试先连上小的，后加大的。 2016-02-27 21:04:28
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| 我最近刚做了一个IN-FUSION跟你的差不多原理，我把我的经验告诉你一下，三个片段同时连接效率很低的，我是把三个片段同时插入到质粒中，片段大小分别是：2.3kb, 1kb, 700bp。我挑了40个班，大约一半的克隆能连进2.3kb的大片段，只有1个克隆三个片段同时插入的。推荐你用高保真酶来扩增你的片段。我们用的NEBQ5 high fidelity, 非常的不错，测序之后没有一个突变。 我看到你有一个6.8kb， 这样效率会很小的，，所以建议你先把大的插进去，在解决那两个小的。别瞎折腾了，这些同时插入的盒子没有说的那么牛，遇到大片段的时候，效率会很低的，建议分布做，这些是个人经验之谈， |
6楼2016-02-27 12:42:21
更恋秋风
铁杆木虫 (小有名气)
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- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2016-02-27 09:24:16
更恋秋风
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3楼2016-02-27 09:24:29
4楼2016-02-27 10:31:55