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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 关于sod pod cat 酶活性的问题
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vaetianr

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于sod pod cat 酶活性的问题 已有1人参与

想问下 我用的番茄植株应该是一个月左右的，处理了老壮叶片和幼叶进行的测试，做了不同处理以及正常叶片，可是测出的酶活都是100以内，看到别的文章做出来的都是300-800的样子，差了一个数量级。（先做了SOD的酶活）做的番茄果实也是这样，都是都是100以为，少了一个数量级。我的是不是实验出了什么问题，我想问下番茄植株及果实在不同发育阶段的SOD POD CAT 的酶活范围是多少？最好详细点~~~
我用的方法是
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。
1、        过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）   (u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、        过氧化氢酶（CAT）活性测定
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）    (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。
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1楼 2015-04-01 11:16:11
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶活测定以你自己得到的数据为准。造成你和别人报道不同的因素很多，譬如植物本身在一棵苗与另一棵间就有差异，同时你的培养环境，测试试剂与仪器都会影响结果。另外，你用样品鲜重计算酶活，这样可以，但你在提取酶时的操作和效率就会影响结果。我比较倾向于测活性氧相关酶活用比活力U/mg蛋白，即对同一提取的样品测一下蛋白含量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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vaetianr
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2015-04-01 14:11:55
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vaetianr

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2015-04-01 14:11:55
酶活测定以你自己得到的数据为准。造成你和别人报道不同的因素很多，譬如植物本身在一棵苗与另一棵间就有差异，同时你的培养环境，测试试剂与仪器都会影响结果。另外，你用样品鲜重计算酶活，这样可以，但你在提取酶 ...

可是差距有那么大么  这样测出来的数据有可信性么？
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3楼2015-04-02 17:48:03
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jiapengyan

新虫 (小有名气)
楼主 你好 我也在测SOD活性，也是用的这个方法，但那个ph7.8 0.05mol/l的磷酸缓冲液怎么配啊 我手头有磷酸二氢钠（二水）和磷酸氢二钠（十二水）
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4楼2015-07-23 12:02:10
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ninxia1

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2016-03-31 15:54:01
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雪艳123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiapengyan at 2015-07-23 12:02:10
楼主 你好 我也在测SOD活性，也是用的这个方法，但那个ph7.8 0.05mol/l的磷酸缓冲液怎么配啊 我手头有磷酸二氢钠（二水）和磷酸氢二钠（十二水）

网上有配置方法，按照比例配，出来的就是相应的pH

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6楼2016-12-30 20:14:16
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wenhong

新虫 (初入文坛)
楼主，我想请教您一个问题。我现在测出来的SOD值，Ack比Ae值大了，算出来肯定是负值，该怎么办啊？是测错了吗？

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7楼2017-03-01 09:30:54
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小瓶瓶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wenhong at 2017-03-01 09:30:54
楼主，我想请教您一个问题。我现在测出来的SOD值，Ack比Ae值大了，算出来肯定是负值，该怎么办啊？是测错了吗？

我的也是这样。 你解决问题了吗?

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8楼2017-07-15 18:41:25
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艺小妹.

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ninxia1 at 2016-03-31 15:54:01
想问下样品鲜重是蛋白量还是什么啊   很迷惑

样品鲜重最好换成蛋白含量
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9楼2017-08-04 21:24:52
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北冥骑神

新虫 (初入文坛)
请问用比活力好还是鲜重好，比活力看用的人比较少

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10楼2019-06-27 08:07:27
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