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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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晨间雾都

新虫 (初入文坛)

[求助] SOD、POD、CAT、LOX酶活性的测定方法 已有1人参与

SOD、POD、CAT、LOX酶活性的测定方法
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酶测定

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1楼 2013-08-02 21:27:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

windygo

木虫 (正式写手)

咸蛋超人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。        
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
SOD总活性＝ /（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。
二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以60个样为准）：
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（3）样品测定：
取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）每30S读数一次。
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）   (u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。
2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=/（W×Vs×0.01×t）    (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

此类方法，许多实验书上都有，药典上也有。
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晨间雾都
我已经开始怀念那些人，那些事了~
2楼2013-08-05 16:04:45
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紫色流星1

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zybpxy at 2013-08-06 16:29:33
试剂盒，我们用南京建成的比较多

他家的试剂盒好用吗？我们现在也需要测SOD 、A-chE指标不知道哪家的使用者靠谱？
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10楼2014-12-02 15:23:41
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普通回帖

yandouble

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

很多实验书上都有，推荐《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅编著，北京市：中国轻工业出版社。你要的这4种酶都有，可以查学校的图书馆，应该有电子版的，如果找不到，我可以从我们学校图书馆帮你查查。我前段时间才测过SOD和CAT，另外，可以直接买试剂盒测，要省事一些
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晨间雾都
3楼2013-08-06 15:40:53
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zybpxy

铁杆木虫 (著名写手)

致斋大人

【答案】应助回帖

试剂盒，我们用南京建成的比较多

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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走的太远，别忘了为何出发
4楼2013-08-06 16:29:33
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晨间雾都

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandouble at 2013-08-06 15:40:53
很多实验书上都有，推荐《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅编著，北京市：中国轻工业出版社。你要的这4种酶都有，可以查学校的图书馆，应该有电子版的，如果找不到，我可以从我们学校图书馆帮你 ...

谢谢！书上的有点麻烦，我想找简单点的~
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5楼2013-08-07 22:46:38
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晨间雾都

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by windygo at 2013-08-05 16:04:45
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2 ...

谢谢哈~不过我觉得书上的而有点复杂，想找简单点的~
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6楼2013-08-07 22:47:33
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晨间雾都

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by windygo at 2013-08-05 16:04:45
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2 ...

除了试剂盒之外的简便方法~
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7楼2013-08-07 22:51:23
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晨间雾都

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandouble at 2013-08-06 15:40:53
很多实验书上都有，推荐《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅编著，北京市：中国轻工业出版社。你要的这4种酶都有，可以查学校的图书馆，应该有电子版的，如果找不到，我可以从我们学校图书馆帮你 ...

除了试剂盒之外的简便方法有木有？
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8楼2013-08-07 22:52:11
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yandouble

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 晨间雾都 at 2013-08-07 22:52:11
除了试剂盒之外的简便方法有木有？...

试剂盒就是比较简单的了，按书上的步骤还更繁琐一些
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9楼2013-08-08 16:19:30
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