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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 关于药典蕲蛇特异性PCR扩增的问题
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destiny516

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于药典蕲蛇特异性PCR扩增的问题 已有3人参与

模板DNA提取  取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取0.1g，置1.5ml离心管中，加入消化液275μl[细胞核裂解液200μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液50μl，蛋白酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液5μl]，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟10000转）3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液800μl[5mol/L醋酸钾溶液26μl，1mol/L Tris-盐酸溶液（pH7.5）18μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液（pH8.0）3μ1，无水乙醇480μl，灭菌双蒸水273μl]，离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转移入另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心（转速为每分钟10000转）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取蕲蛇对照药材0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

以上为15版药典中规定的蕲蛇DNA提取的方法，可是未明确细胞核裂解液和裂解缓冲液的配制方法，求各位大神告知细胞核裂解液和裂解缓冲液的配方？？万分感谢
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1楼 2016-01-29 14:04:48
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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destiny516: 金币+5, ★有帮助 2016-01-29 14:36:23
这实际上就是普通的动物基因组DNA抽提的步骤。
不知楼主是否一定要按照药典的方法来，如果不强制，买个动物基因组DNA抽提试剂盒就好了，省了配制诸多试剂的麻烦。
如果您的样品是中药，我建议您采用深加工产品DNA抽提试剂盒来做，效果会好一点。
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2楼2016-01-29 14:11:15
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destiny516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-29 14:11:15
这实际上就是普通的动物基因组DNA抽提的步骤。
不知楼主是否一定要按照药典的方法来，如果不强制，买个动物基因组DNA抽提试剂盒就好了，省了配制诸多试剂的麻烦。
如果您的样品是中药，我建议您采用深加工产品DNA ...

我们实验室需要过CMA认证，因此必须按照药典的方法来，你有配方吗？
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3楼2016-01-29 14:28:22
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by destiny516 at 2016-01-29 14:28:22
我们实验室需要过CMA认证，因此必须按照药典的方法来，你有配方吗？...

额……这个真没有……
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4楼2016-01-29 14:31:57
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ssswzf

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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3楼: Originally posted by destiny516 at 2016-01-29 14:28:22
我们实验室需要过CMA认证，因此必须按照药典的方法来，你有配方吗？...

说实话，药典只是提供用什么方法去做实验，不可能告诉你用具体的什么试剂配制，如何提取的方法都十分详细，试想一下，如果真的是这样，那试剂盒公司还能有活路吗？药典最多也是告诉你用什么试剂盒而已，所以别费心了...！实话实说，别往心里去
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5楼2016-01-31 16:55:34
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千弦-

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
destiny516: 金币+5 2016-02-02 11:11:10
我以前在学校的时候都是用试剂盒的方法来完成的，不过也尝试过试剂盒前进行一些预处理，也是自己配一下预处理的试剂。不清楚这些预处理的试剂能否通用，楼主可以尝试去查阅相关的文献来得知配制方法。我当时用的是SDS预处理，做的是甲壳类的DNA提取。
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6楼2016-02-01 09:22:18
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千弦-

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
destiny516: 金币+10 2016-02-02 11:11:17
南方医科大学有一篇《华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用 》的论文，也是蕲蛇，可供参考。
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7楼2016-02-01 09:31:11
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destiny516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ssswzf at 2016-01-31 16:55:34
说实话，药典只是提供用什么方法去做实验，不可能告诉你用具体的什么试剂配制，如何提取的方法都十分详细，试想一下，如果真的是这样，那试剂盒公司还能有活路吗？药典最多也是告诉你用什么试剂盒而已，所以别费 ...

关键是药典没有写用试剂盒，涉及到实验室认证，用试剂盒可能存在风险
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8楼2016-02-02 11:10:41
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destiny516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 千弦- at 2016-02-01 09:22:18
我以前在学校的时候都是用试剂盒的方法来完成的，不过也尝试过试剂盒前进行一些预处理，也是自己配一下预处理的试剂。不清楚这些预处理的试剂能否通用，楼主可以尝试去查阅相关的文献来得知配制方法。我当时用的是S ...

谢谢
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9楼2016-02-02 11:11:04
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adamhe

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

研究蕲蛇的很棒，我就是李时珍的老乡。对于提取蕲蛇的DNA，可以用多糖多蛋白的DNA提取试剂盒，这个倒是可以的。用高一点浓度的SDS处理时间长一点。鉴定物种特异性的PCR，这个主要还是找出不同的基因，然后设计不同的引物进行验证。16S,5.8S是一个不错的方法，若找不出特异的基因的话。
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10楼2016-02-02 11:17:06
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