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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 关于red重组的问题
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cyl-1

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于red重组的问题 已有1人参与

各位虫友大家好，最近在做red重组敲除沙门氏菌的两个基因，其中有一个已经做成功，另外一个在转入同源壁片段之后，在抗性板子上长出了几个斑，挑斑用抗性LB摇菌。在要敲除的基因两侧和内部分别设计两对引物进行pcr鉴定，这时奇怪的事发生了，在基因两侧设计的引物扩增出来两条带，一大一小，测序后大的一条为该目的基因序列，小的一条为抗性基因序列，为什么会发生这种事，抗性片段应该是交换上去了，不然在抗性板子上不会长，应该没有污染，每次都做了阴性对照，没有条带，而且后来用菌液划了两次抗性板子挑单菌落 纯化，但是还是扩展出来两条带，基本可以排除污染的可能。后来我在genebank上找了一下标准沙门的序列，没有多拷贝，到底是怎么回事？？？求高手指导。

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1楼 2016-01-15 16:06:54
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poiu250

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-26 08:39:50
请问楼主知道，怎么利用设计引物，来鉴定敲除10来个碱基的小鼠吗？设计的原理是 什么？
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3楼2016-10-22 13:24:31
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cyl-1

铜虫 (初入文坛)
内部的引物也扩出和野生株一样的条带

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2楼2016-01-15 16:08:05
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cyl-1

铜虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-26 08:39:56
引用回帖:
3楼: Originally posted by poiu250 at 2016-10-22 13:24:31
请问楼主知道，怎么利用设计引物，来鉴定敲除10来个碱基的小鼠吗？设计的原理是 什么？

提取敲除了基因的小鼠基因组，在你敲除的基因两侧设计引物，pcr扩增然后测序比对就知道了

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4楼2016-10-26 08:02:59
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