应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 关于大肠杆菌同源重组敲除基因的问题——请大家赐教！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
141/2返回列表12下一页
查看: 2976  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

LYforever

新虫 (小有名气)

[求助] 关于大肠杆菌同源重组敲除基因的问题——请大家赐教！ 已有5人参与

最近在做大肠杆菌的基因缺失，用的是Red同源重组系统，一次重组已经完成，并测序正确，但最近一直卡在二次重组，每次电转后涂布到A+C的平板上（傍晚），第二天早上就会发现平板上长一层菌苔，涂布棒涂到的地方整个一片，已经重复做了很多次，但还是同样的问题，一直都不知道问题到底出在哪里，不知道如何是好，恳请前辈们赐教！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-10-15 21:56:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

tolobio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
如果在大肠杆菌中做的话，我们成熟的做法是：先转入pKD46（或类似），然后开始诱导（注意菌株的状态，OD，以及阿拉伯糖要新鲜），最后做成感受态（电转化，现做现用）。
DNA方面，一般是通过PCR的方法，把抗性基因扩增下来，两端带有40nt（或以上）的同源臂（与待敲除基因的两端同源）。PCR产物一定要经过DpnI处理（去除之前的模板质粒），割胶纯化，然后elute到ddH2O中。再把DNA电转化到感受态中即可筛选。
好像不需要两次交换（先单交换后双交换？没有必要）。如需继续交流，欢迎联系我们：tolobio@126.com；或者support@tolobio.com
www.tolobio.com
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2015-10-19 06:49:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

专吃虫

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大肠长得太快了，你不应该过夜的，培养几个小时就行了，本来涂布就有很多菌了，再长那么快肯定成菌台了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2015-10-16 07:29:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
培养时间短一点看看。
赞一下 回复此楼
蓝精灵
3楼2015-10-16 08:10:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把菌的浓度降低一点，培养时间缩短。建议重新更换抗生素，感觉有抗生素失效的可能性
赞一下 回复此楼
小虫虫~~
4楼2015-10-16 08:42:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

老蔡文

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一次的pCP20没cure掉？
赞一下 回复此楼
5楼2015-10-18 17:10:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 老蔡文 at 2015-10-18 17:10:13
第一次的pCP20没cure掉？

第一次用的pKD46

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
6楼2015-10-18 21:50:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡亚梅 at 2015-10-16 08:42:12
把菌的浓度降低一点，培养时间缩短。建议重新更换抗生素，感觉有抗生素失效的可能性

好的，我试试，谢谢

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
7楼2015-10-18 21:51:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mlanqiang at 2015-10-16 08:10:03
培养时间短一点看看。

培养时间调了，现在倒是什么都不长了，不知是好是坏

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
8楼2015-10-18 21:52:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 专吃虫 at 2015-10-16 07:29:44
大肠长得太快了，你不应该过夜的，培养几个小时就行了，本来涂布就有很多菌了，再长那么快肯定成菌台了

毕竟是筛选重组菌，效率不高的，不可能那一片菌苔都是阳性重组子啊

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
9楼2015-10-18 21:53:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 LYforever 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿吉大化学327求调剂 +4 王王白石 2026-04-06 5/250 2026-04-06 20:07 by 尚水阁主
[考研] 071000生物学调剂 +7 拉提桃 2026-04-06 7/350 2026-04-06 18:55 by 52305043001
[考研] 机械专硕274求调剂，不挑专业学校 +6 泛泛2333 2026-04-05 8/400 2026-04-06 18:06 by 泛泛2333
[考研] 274求调剂求调剂 +5 Jachenbingoo 2026-04-06 5/250 2026-04-06 17:20 by 蓝云思雨
[考研] 277工科求调剂 +8 1915668 2026-04-04 9/450 2026-04-06 15:52 by lin-da
[考研] 288求调剂 +8 没有答案_ 2026-04-05 8/400 2026-04-06 14:11 by lqwchd
[考研] 08600生物与医药-327 +8 18755400796 2026-04-05 8/400 2026-04-06 11:59 by lijunpoly
[考研] 292求调剂 +3 lilllllxccc 2026-04-05 4/200 2026-04-06 10:39 by 蓝云思雨
[考研] 0817化学工程与技术求调剂，一志愿中海洋319 +14 lv945 2026-04-04 14/700 2026-04-06 10:20 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿南昌大学，085600，344分求调剂 +9 调剂上岸玘 2026-04-05 10/500 2026-04-06 09:30 by dongzh2009
[考研] 调剂 一志愿吉林大学357分 +5 .Starry. 2026-04-04 5/250 2026-04-06 09:28 by cql1109
[考研] 求调剂到0856材料工程 +3 程9915 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:15 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿东北大学085901土木专硕345求调剂 +3 zxt11111 2026-04-04 3/150 2026-04-04 14:21 by 土木硕士招生
[考研] 学硕288调剂!!! +3 小王xw123 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:20 by 啵啵啵0119
[考研] 考研调剂 +3 Draa 2026-04-03 3/150 2026-04-03 17:37 by hgwz7468
[基金申请] 请问共同通讯和共同一作的认可度问题 10+4 psa1234 2026-04-01 10/500 2026-04-03 11:08 by Kittylucky
[考研] 085601一志愿中山大学深圳材料工程330求调剂 +8 pipiver 2026-03-30 8/400 2026-04-02 12:01 by ms629
[考研] 286求调剂 +5 Sa67890. 2026-04-01 7/350 2026-04-01 19:50 by 6781022
[考研] 环境工程调剂 +9 hyzzzzzzz. 2026-04-01 9/450 2026-04-01 14:20 by salamander`
[考研] 福建理工大学材料学院先进合金团队招收考研调剂学生 +3 大华金商都 2026-03-30 4/200 2026-03-31 01:04 by 方英俊602
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭