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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 关于大肠杆菌同源重组敲除基因的问题——请大家赐教！
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LYforever

新虫 (小有名气)

[求助] 关于大肠杆菌同源重组敲除基因的问题——请大家赐教！ 已有5人参与

最近在做大肠杆菌的基因缺失，用的是Red同源重组系统，一次重组已经完成，并测序正确，但最近一直卡在二次重组，每次电转后涂布到A+C的平板上（傍晚），第二天早上就会发现平板上长一层菌苔，涂布棒涂到的地方整个一片，已经重复做了很多次，但还是同样的问题，一直都不知道问题到底出在哪里，不知道如何是好，恳请前辈们赐教！
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1楼 2015-10-15 21:56:56
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tolobio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
如果在大肠杆菌中做的话，我们成熟的做法是：先转入pKD46（或类似），然后开始诱导（注意菌株的状态，OD，以及阿拉伯糖要新鲜），最后做成感受态（电转化，现做现用）。
DNA方面，一般是通过PCR的方法，把抗性基因扩增下来，两端带有40nt（或以上）的同源臂（与待敲除基因的两端同源）。PCR产物一定要经过DpnI处理（去除之前的模板质粒），割胶纯化，然后elute到ddH2O中。再把DNA电转化到感受态中即可筛选。
好像不需要两次交换（先单交换后双交换？没有必要）。如需继续交流，欢迎联系我们：tolobio@126.com；或者support@tolobio.com
www.tolobio.com
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10楼2015-10-19 06:49:45
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普通回帖

专吃虫

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大肠长得太快了，你不应该过夜的，培养几个小时就行了，本来涂布就有很多菌了，再长那么快肯定成菌台了

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2楼2015-10-16 07:29:44
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
培养时间短一点看看。
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蓝精灵
3楼2015-10-16 08:10:03
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胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把菌的浓度降低一点，培养时间缩短。建议重新更换抗生素，感觉有抗生素失效的可能性
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小虫虫~~
4楼2015-10-16 08:42:12
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老蔡文

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一次的pCP20没cure掉？
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5楼2015-10-18 17:10:13
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LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 老蔡文 at 2015-10-18 17:10:13
第一次的pCP20没cure掉？

第一次用的pKD46

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6楼2015-10-18 21:50:50
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LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡亚梅 at 2015-10-16 08:42:12
把菌的浓度降低一点，培养时间缩短。建议重新更换抗生素，感觉有抗生素失效的可能性

好的，我试试，谢谢

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7楼2015-10-18 21:51:33
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LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mlanqiang at 2015-10-16 08:10:03
培养时间短一点看看。

培养时间调了，现在倒是什么都不长了，不知是好是坏

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8楼2015-10-18 21:52:15
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LYforever

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 专吃虫 at 2015-10-16 07:29:44
大肠长得太快了，你不应该过夜的，培养几个小时就行了，本来涂布就有很多菌了，再长那么快肯定成菌台了

毕竟是筛选重组菌，效率不高的，不可能那一片菌苔都是阳性重组子啊

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9楼2015-10-18 21:53:24
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