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LYforever新虫 (小有名气)
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关于大肠杆菌同源重组敲除基因的问题——请大家赐教！ 已有5人参与
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| 最近在做大肠杆菌的基因缺失，用的是Red同源重组系统，一次重组已经完成，并测序正确，但最近一直卡在二次重组，每次电转后涂布到A+C的平板上（傍晚），第二天早上就会发现平板上长一层菌苔，涂布棒涂到的地方整个一片，已经重复做了很多次，但还是同样的问题，一直都不知道问题到底出在哪里，不知道如何是好，恳请前辈们赐教！ |
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【答案】应助回帖
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如果在大肠杆菌中做的话，我们成熟的做法是：先转入pKD46（或类似），然后开始诱导（注意菌株的状态，OD，以及阿拉伯糖要新鲜），最后做成感受态（电转化，现做现用）。 DNA方面，一般是通过PCR的方法，把抗性基因扩增下来，两端带有40nt（或以上）的同源臂（与待敲除基因的两端同源）。PCR产物一定要经过DpnI处理（去除之前的模板质粒），割胶纯化，然后elute到ddH2O中。再把DNA电转化到感受态中即可筛选。 好像不需要两次交换（先单交换后双交换？没有必要）。如需继续交流，欢迎联系我们：tolobio@126.com；或者support@tolobio.com www.tolobio.com |
10楼2015-10-19 06:49:45
2楼2015-10-16 07:29:44
mlanqiang
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