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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 分子克隆问题求助
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胡程

银虫 (小有名气)

[求助] 分子克隆问题求助 已有9人参与

各位同仁：大家好，咨询一个问题。做分子克隆，载体与片段连接后（室温1小时）加入感受态dh5α，冰上30分钟，然后42热激1分钟，37℃，260转摇35分钟，然后离心涂板，过夜长成这个吊样，以前做的都长得挺好，只是这两天问题百出，求分析原因啊，必有重谢。ps：①为了排除涂板问题的干扰，一个是用磁珠涂布的，一个没有磁珠涂板
②为了排除质粒问题，做了一个其他质粒的control。③板子为amp抗性，和我一起做实验的一些人都能长得很好。跪求！！

分子克隆问题求助
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分子克隆问题求助-1
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做最好的自己
1楼 2015-12-27 09:21:50
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胡程

银虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by zht930528 at 2015-12-28 11:49:48
说下我们这里的操作，之前的都一样，然后42℃热激90s  ，之后是有一个5min的冰浴的，然后再加无抗LB复苏40min-60min。之后离心涂板。建议检查amp。感觉像是抗生素失效。或者菌液复苏导致浓度过高

谢谢，我做了一个直接涂板的对照（没有离心）和amp的对照，然而同样的结果，我在怀疑是以前的操作引来的。
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做最好的自己
36楼2015-12-29 11:18:37
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yilberg

新虫 (小有名气)
我是这样做的：冰上30min，42度90s，冰上5min，然后过夜，220rpm/min 37度 4小时。离心，涂板，没出现过你这种情况。dh5a 是用的takara

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2楼2015-12-27 09:30:56
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yilberg

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yilberg at 2015-12-27 09:30:56
我是这样做的：冰上30min，42度90s，冰上5min，然后过夜，220rpm/min 37度 4小时。离心，涂板，没出现过你这种情况。dh5a 是用的takara

过夜是连接的时候。转化不过夜的。打错了

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3楼2015-12-27 09:32:41
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡程: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，希望进一步交流分析。 2015-12-27 14:26:58
我就问你一句，AMP加了多少。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
4楼2015-12-27 11:31:36
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