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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白？
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
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20楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-26 21:43:53
如果3端带有终止码的话，这个应该没问题。
但是表达出来的蛋白在N端多了巨多的氨基酸，还有，你特别需要T7 tag来做抗体么？
N端的多余氨基酸太多，有可能会影响抗体识别。
这里可以尝试做一个小量纯化跑胶看看。 ...

是只有一端有His标签的，另一端加了终止密码子的，是想拿纯化的蛋白包被做间接ELISA检测
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21楼2015-12-26 23:14:35
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 23:14:35
是只有一端有His标签的，另一端加了终止密码子的，是想拿纯化的蛋白包被做间接ELISA检测...

尝试分析一下密码子偏好性吧
载体骨架如果没什么问题的话，多了点氨基酸不至于会表达不出。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
22楼2015-12-26 23:22:28
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tj113578888

金虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 21:28:24
为啥这么做，不诱导怎么表达，表达量很低吧，有啥理论依据吗？...

有些蛋白在诱导条件下反而不表达甚至很少，跟蛋白自身有关，你可按照我说的方法试下，说不定蛋白还能表达在上清，我构建的按这个方法上清都有量可观的蛋白，还不担心活性问题

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不求事事顺心，但求问心无愧
23楼2015-12-26 23:30:30
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by tj113578888 at 2015-12-26 23:30:30
有些蛋白在诱导条件下反而不表达甚至很少，跟蛋白自身有关，你可按照我说的方法试下，说不定蛋白还能表达在上清，我构建的按这个方法上清都有量可观的蛋白，还不担心活性问题
...

好的，谢谢
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24楼2015-12-27 15:41:08
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-26 23:22:28
尝试分析一下密码子偏好性吧
载体骨架如果没什么问题的话，多了点氨基酸不至于会表达不出。...

好的，谢谢
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25楼2015-12-27 15:41:48
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

蛋白不表达有很多原因
1.诱导条件
蛋白的表达要考虑诱导时间、温度、IPTG浓度等，任何一个都会造成不表达或之所以检测不到，可能是诱导的蛋白已经降解。一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（如果有诱导后死菌情况可以适当降低浓度）；诱导温度37、28、16诱导的都有，一般想要得到溶合蛋白是要低温诱导的；相应的诱导时间 37度（6-8h）、28度（过夜诱导）、16度（过夜诱导），自己尝试着摸最佳条件
2.载体构建错误
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
3.蛋白酶将蛋白降解了
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg R,Leu L, Lys K, Phe F, Trp W,或 Tyr Y这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
4.表达量很少
在原核表达纯化中，带有重组蛋白的菌株因低效表达而死亡，剩下的都是带有空质粒的菌株划平板。
等等，楼主看看你的蛋白有没有人做过，有人做过最好不过了，可以确定一下条件，没人做过只能自己摸索宿主、诱导条件、载体等条件了。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
26楼2015-12-28 09:39:14
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-12-28 09:39:14
蛋白不表达有很多原因
1.诱导条件
蛋白的表达要考虑诱导时间、温度、IPTG浓度等，任何一个都会造成不表达或之所以检测不到，可能是诱导的蛋白已经降解。一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（如果有诱导后死菌 ...

好
27楼2015-12-28 12:05:20
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wp田宇

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 03:07:28
你搞清楚！BL21不能表达PET，必须DE3的才可以，BL21 DE3 ，Rosetta DE3都行，用BL21鬼都出不来，根本没有T7启动子。

你好，想问下，如果我的PET-28a质粒上的T7启动子敲除掉，在原位上换上一个新的启动子---色氨酸串联启动子(ptrp*2)，启动子后面紧跟我的目的基因，我在不加入IPTG和加入IPTG诱导两种情况下，跑全细胞SDS-PAGE都没有目的蛋白表达。请您能给点建议吗？？？谢谢
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努力让自己做到金钱和修养的统一！！
28楼2015-12-28 21:55:44
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by wp田宇 at 2015-12-28 21:55:44
你好，想问下，如果我的PET-28a质粒上的T7启动子敲除掉，在原位上换上一个新的启动子---色氨酸串联启动子(ptrp*2)，启动子后面紧跟我的目的基因，我在不加入IPTG和加入IPTG诱导两种情况下，跑全细胞SDS-PAGE都没有 ...

没用过这个启动子，这个是色氨酸缺乏时才表达的么？ 不是特别清楚，所以可能帮不了你呢。
但是 启动子后面紧跟目的基因的话，恐怕是不行的。
启动子启动RNA的转录，但蛋白质翻译的启动不仅仅依赖于ATG的读码，还需要RNA 5‘端的一个的特殊帽子结构，一般称为KOZAK序列，具体可以百度下。
启动子后面应该要跟上这个，才能正确定位到核糖体里进行翻译。
结构应该是
Promoter-Kozak-Restriction site-CODE Region..
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
29楼2015-12-28 22:25:33
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by wp田宇 at 2015-12-28 21:55:44
你好，想问下，如果我的PET-28a质粒上的T7启动子敲除掉，在原位上换上一个新的启动子---色氨酸串联启动子(ptrp*2)，启动子后面紧跟我的目的基因，我在不加入IPTG和加入IPTG诱导两种情况下，跑全细胞SDS-PAGE都没有 ...

似乎原核生物中，Kozak序列叫SD序列。
Kozak是真核生物的
SD是原核的
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
30楼2015-12-28 22:27:10
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