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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你最初的描述,我觉得很多不准确的地方,比如诱导4h,前面经过转接了么?转接前OD值是多少,转接后加IPTG时OD值是多少。
测序没问题,是指没突变还是从tag位置到前后读框都没问题,还是仅仅对了一下没有突变而已,我觉得至少会有一点本底表达,一点都没有的概率很小,再找找序列上的问题。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
11楼2015-12-25 16:24:11
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tj113578888

金虫 (小有名气)

不求事事顺心,但求问心无愧
12楼2015-12-25 16:26:52
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by tj113578888 at 2015-12-25 16:26:52
我知道怎么做

怎么做

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
13楼2015-12-26 12:00:56
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 16:24:11
看你最初的描述,我觉得很多不准确的地方,比如诱导4h,前面经过转接了么?转接前OD值是多少,转接后加IPTG时OD值是多少。
测序没问题,是指没突变还是从tag位置到前后读框都没问题,还是仅仅对了一下没有突变而已 ...

转接前没测OD,转接后OD值是0.6开始诱导的,测序后比对了氨基酸序列与酶切位点,都没问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
14楼2015-12-26 12:04:09
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tj113578888

金虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 12:00:56
怎么做
...

不诱导,摇14小时左右,37℃

发自小木虫Android客户端
不求事事顺心,但求问心无愧
15楼2015-12-26 13:06:29
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 12:04:09
转接前没测OD,转接后OD值是0.6开始诱导的,测序后比对了氨基酸序列与酶切位点,都没问题
...

哪两个酶切位点
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
16楼2015-12-26 20:09:27
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-26 20:09:27
哪两个酶切位点...

ECOR1和Xho1
17楼2015-12-26 21:27:19
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by tj113578888 at 2015-12-26 13:06:29
不诱导,摇14小时左右,37℃
...

为啥这么做,不诱导怎么表达,表达量很低吧,有啥理论依据吗?
18楼2015-12-26 21:28:24
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wenda2015

新虫 (初入文坛)

19楼2015-12-26 21:37:52
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 21:27:19
ECOR1和Xho1...

如果3端带有终止码的话,这个应该没问题。
但是表达出来的蛋白在N端多了巨多的氨基酸,还有,你特别需要T7 tag来做抗体么?
N端的多余氨基酸太多,有可能会影响抗体识别。
这里可以尝试做一个小量纯化跑胶看看。
不诱导,摇14小时左右,37℃那个是BL21 DE3并非严谨表达型菌种,质粒会存在少量本底表达。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
20楼2015-12-26 21:43:53
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