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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白？
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你最初的描述，我觉得很多不准确的地方，比如诱导4h，前面经过转接了么？转接前OD值是多少，转接后加IPTG时OD值是多少。
测序没问题，是指没突变还是从tag位置到前后读框都没问题，还是仅仅对了一下没有突变而已，我觉得至少会有一点本底表达，一点都没有的概率很小，再找找序列上的问题。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
11楼2015-12-25 16:24:11
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tj113578888

金虫 (小有名气)
我知道怎么做

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不求事事顺心，但求问心无愧
12楼2015-12-25 16:26:52
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by tj113578888 at 2015-12-25 16:26:52
我知道怎么做

怎么做

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2015-12-26 12:00:56
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 16:24:11
看你最初的描述，我觉得很多不准确的地方，比如诱导4h，前面经过转接了么？转接前OD值是多少，转接后加IPTG时OD值是多少。
测序没问题，是指没突变还是从tag位置到前后读框都没问题，还是仅仅对了一下没有突变而已 ...

转接前没测OD，转接后OD值是0.6开始诱导的，测序后比对了氨基酸序列与酶切位点，都没问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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14楼2015-12-26 12:04:09
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tj113578888

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 12:00:56
怎么做
...

不诱导，摇14小时左右，37℃

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不求事事顺心，但求问心无愧
15楼2015-12-26 13:06:29
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 12:04:09
转接前没测OD，转接后OD值是0.6开始诱导的，测序后比对了氨基酸序列与酶切位点，都没问题
...

哪两个酶切位点
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
16楼2015-12-26 20:09:27
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-26 20:09:27
哪两个酶切位点...

ECOR1和Xho1
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17楼2015-12-26 21:27:19
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by tj113578888 at 2015-12-26 13:06:29
不诱导，摇14小时左右，37℃
...

为啥这么做，不诱导怎么表达，表达量很低吧，有啥理论依据吗？
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18楼2015-12-26 21:28:24
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wenda2015

新虫 (初入文坛)
可以换换培养基试试

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19楼2015-12-26 21:37:52
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 21:27:19
ECOR1和Xho1...

如果3端带有终止码的话，这个应该没问题。
但是表达出来的蛋白在N端多了巨多的氨基酸，还有，你特别需要T7 tag来做抗体么？
N端的多余氨基酸太多，有可能会影响抗体识别。
这里可以尝试做一个小量纯化跑胶看看。
不诱导，摇14小时左右，37℃那个是BL21 DE3并非严谨表达型菌种，质粒会存在少量本底表达。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
20楼2015-12-26 21:43:53
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