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雪晴2013

金虫 (正式写手)

[求助] 原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白? 已有3人参与

表达np基因的部分片段,大概1100bp,克隆到pet28a上,在BL21中,IPTG1mm,37*,200r表达4h,然后取诱导、未诱导全菌直接跑的PAGE,看不出差异带,测序鉴定证明序列没有问题,为什么蛋白没有表达呢?
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-26 21:27:19
ECOR1和Xho1...

如果3端带有终止码的话,这个应该没问题。
但是表达出来的蛋白在N端多了巨多的氨基酸,还有,你特别需要T7 tag来做抗体么?
N端的多余氨基酸太多,有可能会影响抗体识别。
这里可以尝试做一个小量纯化跑胶看看。
不诱导,摇14小时左右,37℃那个是BL21 DE3并非严谨表达型菌种,质粒会存在少量本底表达。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
20楼2015-12-26 21:43:53
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bhl2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
过夜菌 培养到对数期之后进行诱导的吗

发自小木虫IOS客户端
2楼2015-12-24 16:15:33
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bhl2012 at 2015-12-24 16:15:33
过夜菌 培养到对数期之后进行诱导的吗

培养过夜后,1:100转种培养到对数生长期再诱导的
3楼2015-12-24 21:55:15
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你搞清楚!BL21不能表达PET,必须DE3的才可以,BL21 DE3 ,Rosetta DE3都行,用BL21鬼都出不来,根本没有T7启动子。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
4楼2015-12-25 03:07:28
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