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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白？
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雪晴2013

金虫 (正式写手)

[求助] 原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白？ 已有3人参与

表达np基因的部分片段，大概1100bp，克隆到pet28a上，在BL21中，IPTG1mm，37*，200r表达4h，然后取诱导、未诱导全菌直接跑的PAGE，看不出差异带，测序鉴定证明序列没有问题，为什么蛋白没有表达呢？
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1楼 2015-12-24 16:05:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-25 10:23:03
是BL21 DE3，我没说清楚，sorry...

做上请与沉淀的对照，降低诱导温度到26度至16度之间，降低IPTG浓度0.1mM甚至更低，增加诱导时间2-6小时之间。再试试
转化完的板子不要放在低温下，整个过程不要让表达菌受到低温刺激，再试试。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
6楼2015-12-25 12:55:04
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

蛋白不表达有很多原因
1.诱导条件
蛋白的表达要考虑诱导时间、温度、IPTG浓度等，任何一个都会造成不表达或之所以检测不到，可能是诱导的蛋白已经降解。一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（如果有诱导后死菌情况可以适当降低浓度）；诱导温度37、28、16诱导的都有，一般想要得到溶合蛋白是要低温诱导的；相应的诱导时间 37度（6-8h）、28度（过夜诱导）、16度（过夜诱导），自己尝试着摸最佳条件
2.载体构建错误
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
3.蛋白酶将蛋白降解了
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg R,Leu L, Lys K, Phe F, Trp W,或 Tyr Y这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
4.表达量很少
在原核表达纯化中，带有重组蛋白的菌株因低效表达而死亡，剩下的都是带有空质粒的菌株划平板。
等等，楼主看看你的蛋白有没有人做过，有人做过最好不过了，可以确定一下条件，没人做过只能自己摸索宿主、诱导条件、载体等条件了。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
26楼2015-12-28 09:39:14
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普通回帖

bhl2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
过夜菌 培养到对数期之后进行诱导的吗

发自小木虫IOS客户端
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2楼2015-12-24 16:15:33
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bhl2012 at 2015-12-24 16:15:33
过夜菌 培养到对数期之后进行诱导的吗

培养过夜后，1:100转种培养到对数生长期再诱导的
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3楼2015-12-24 21:55:15
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你搞清楚！BL21不能表达PET，必须DE3的才可以，BL21 DE3 ，Rosetta DE3都行，用BL21鬼都出不来，根本没有T7启动子。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
4楼2015-12-25 03:07:28
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 03:07:28
你搞清楚！BL21不能表达PET，必须DE3的才可以，BL21 DE3 ，Rosetta DE3都行，用BL21鬼都出不来，根本没有T7启动子。

是BL21 DE3，我没说清楚，sorry
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5楼2015-12-25 10:23:03
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王春景moon
，

发自小木虫Android客户端
7楼2015-12-25 13:06:29
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 12:55:04
做上请与沉淀的对照，降低诱导温度到26度至16度之间，降低IPTG浓度0.1mM甚至更低，增加诱导时间2-6小时之间。再试试
转化完的板子不要放在低温下，整个过程不要让表达菌受到低温刺激，再试试。...

拿诱导的全菌做过western，没有条带，估计是没有表达了
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8楼2015-12-25 14:31:30
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雪晴2013 at 2015-12-25 14:31:30
拿诱导的全菌做过western，没有条带，估计是没有表达了...

才做一次，这结论太早。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
9楼2015-12-25 14:39:45
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雪晴2013

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-25 14:39:45
才做一次，这结论太早。...

诱导好多次，western做了一次，最近想延长诱导时间试一下
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10楼2015-12-25 14:48:14
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