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雪晴2013金虫 (正式写手)
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[求助]
原核pet28a表达的菌株诱导不出目的蛋白？ 已有3人参与
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| 表达np基因的部分片段，大概1100bp，克隆到pet28a上，在BL21中，IPTG1mm，37*，200r表达4h，然后取诱导、未诱导全菌直接跑的PAGE，看不出差异带，测序鉴定证明序列没有问题，为什么蛋白没有表达呢？ |
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【答案】应助回帖
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蛋白不表达有很多原因 1.诱导条件 蛋白的表达要考虑诱导时间、温度、IPTG浓度等，任何一个都会造成不表达或之所以检测不到，可能是诱导的蛋白已经降解。一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（如果有诱导后死菌情况可以适当降低浓度）；诱导温度37、28、16诱导的都有，一般想要得到溶合蛋白是要低温诱导的；相应的诱导时间 37度（6-8h）、28度（过夜诱导）、16度（过夜诱导），自己尝试着摸最佳条件 2.载体构建错误 这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。 3.蛋白酶将蛋白降解了 这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg R,Leu L, Lys K, Phe F, Trp W,或 Tyr Y这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。 4.表达量很少 在原核表达纯化中，带有重组蛋白的菌株因低效表达而死亡，剩下的都是带有空质粒的菌株划平板。 等等，楼主看看你的蛋白有没有人做过，有人做过最好不过了，可以确定一下条件，没人做过只能自己摸索宿主、诱导条件、载体等条件了。 |
26楼2015-12-28 09:39:14
2楼2015-12-24 16:15:33
雪晴2013
金虫 (正式写手)
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3楼2015-12-24 21:55:15
siriusxuan
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4楼2015-12-25 03:07:28
30