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宋宋6

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶 已有9人参与

最近总高保真酶primestar,死活扩不出来。怀疑是不是我程序的问题。你们都是怎么设置程序的?而且还遇到一个问题是,pcr为什么有时候出带,有时候不出带呢。

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X小天T

金虫 (正式写手)


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引用回帖:
6楼: Originally posted by 宋宋6 at 2015-12-25 10:45:47
我想知道是不是我具体的程序错了。说明书上没有预变形,是不是没有预变形,也没有终延伸那一步。说明书上虽然没有,这应该是公认的吧
...

takara,预变性温度我们用的95℃,变性温度,普通的94℃ 变性时间30s。高保真是98℃ 变性时间10s,我们是这么做的。

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9楼2015-12-25 12:24:25
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查看全部 12 个回答

X小天T

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
程序的话按照说明书上的一般没问题,只不过不同的引物所需要的退火温度不同,所以,最好先用梯度PCR,普通的酶,确定最佳退火温度,然后再用高保真酶P目的片段。还有,你的目的条带是不是特别长,要根据不同长度设置延伸时间(我们用的TAKARA的酶,是说明书上的的时间的1.5倍)。对于不出条带原因是多方面的,具体原因具体分析(额...感觉想废话一样,不过确实是这样)
2楼2015-12-23 21:02:17
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scofield111

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
退火温度做梯度,真有钱,prime star 贵死

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3楼2015-12-24 11:57:41
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足下客

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
保真性越好,扩增效率越低。高保真酶就是不好扩,而且有些基因本身就是不好扩的。
4楼2015-12-24 14:08:25
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