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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶
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宋宋6

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶 已有9人参与

最近总高保真酶primestar，死活扩不出来。怀疑是不是我程序的问题。你们都是怎么设置程序的？而且还遇到一个问题是，pcr为什么有时候出带，有时候不出带呢。

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1楼 2015-12-23 19:11:15
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X小天T

金虫 (正式写手)
★
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程序的话按照说明书上的一般没问题，只不过不同的引物所需要的退火温度不同，所以，最好先用梯度PCR，普通的酶，确定最佳退火温度，然后再用高保真酶P目的片段。还有，你的目的条带是不是特别长，要根据不同长度设置延伸时间（我们用的TAKARA的酶，是说明书上的的时间的1.5倍）。对于不出条带原因是多方面的，具体原因具体分析（额...感觉想废话一样，不过确实是这样）
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2楼2015-12-23 21:02:17
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scofield111

银虫 (正式写手)
★
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退火温度做梯度，真有钱，prime star 贵死

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3楼2015-12-24 11:57:41
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足下客

木虫 (正式写手)
★
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保真性越好，扩增效率越低。高保真酶就是不好扩，而且有些基因本身就是不好扩的。
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4楼2015-12-24 14:08:25
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)
★
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我也有类似情况，有的基因很难扩；还有，官方的程序，我从来没有成功过，都是用普通PCR的程序P的，记得PrimeStar官方的程序说是变性时间5s或15s，好短，退火时间好像也非常短，反正，我是扩不出来，同实验室的也是，最后都是用自己普通的程序P的，效果还可以。
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让羽毛再飞一会儿
5楼2015-12-25 09:29:53
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宋宋6

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by X小天T at 2015-12-23 21:02:17
程序的话按照说明书上的一般没问题，只不过不同的引物所需要的退火温度不同，所以，最好先用梯度PCR，普通的酶，确定最佳退火温度，然后再用高保真酶P目的片段。还有，你的目的条带是不是特别长，要根据不同长度设置 ...

我想知道是不是我具体的程序错了。说明书上没有预变形，是不是没有预变形，也没有终延伸那一步。说明书上虽然没有，这应该是公认的吧

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6楼2015-12-25 10:45:47
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)
★
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我最近也是啊，好烦，用的也是primestar这个。。。之前都跑的出来。。。

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7楼2015-12-25 11:06:54
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tfytli

金虫 (职业作家)
★
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换模板试一下，cDNA不好扩，换质粒模板试试

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最令人信服的话莫过于一本正经的胡说八道，外加一点数据。
8楼2015-12-25 11:26:16
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X小天T

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 宋宋6 at 2015-12-25 10:45:47
我想知道是不是我具体的程序错了。说明书上没有预变形，是不是没有预变形，也没有终延伸那一步。说明书上虽然没有，这应该是公认的吧
...

takara，预变性温度我们用的95℃，变性温度，普通的94℃ 变性时间30s。高保真是98℃ 变性时间10s，我们是这么做的。

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9楼2015-12-25 12:24:25
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木南楠

新虫 (初入文坛)
★
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什么酶可以代替primestar吗？overlap PCR两个扩增片段连接，想用别的酶代替primestar，不知道可不可以，求助大神！
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10楼2016-05-31 21:26:59
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