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宋宋6

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶 已有9人参与

最近总高保真酶primestar,死活扩不出来。怀疑是不是我程序的问题。你们都是怎么设置程序的?而且还遇到一个问题是,pcr为什么有时候出带,有时候不出带呢。

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X小天T

金虫 (正式写手)


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程序的话按照说明书上的一般没问题,只不过不同的引物所需要的退火温度不同,所以,最好先用梯度PCR,普通的酶,确定最佳退火温度,然后再用高保真酶P目的片段。还有,你的目的条带是不是特别长,要根据不同长度设置延伸时间(我们用的TAKARA的酶,是说明书上的的时间的1.5倍)。对于不出条带原因是多方面的,具体原因具体分析(额...感觉想废话一样,不过确实是这样)
2楼2015-12-23 21:02:17
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scofield111

银虫 (正式写手)


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退火温度做梯度,真有钱,prime star 贵死

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3楼2015-12-24 11:57:41
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足下客

木虫 (正式写手)


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保真性越好,扩增效率越低。高保真酶就是不好扩,而且有些基因本身就是不好扩的。
4楼2015-12-24 14:08:25
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)


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我也有类似情况,有的基因很难扩;还有,官方的程序,我从来没有成功过,都是用普通PCR的程序P的,记得PrimeStar官方的程序说是变性时间5s或15s,好短,退火时间好像也非常短,反正,我是扩不出来,同实验室的也是,最后都是用自己普通的程序P的,效果还可以。
让羽毛再飞一会儿
5楼2015-12-25 09:29:53
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宋宋6

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by X小天T at 2015-12-23 21:02:17
程序的话按照说明书上的一般没问题,只不过不同的引物所需要的退火温度不同,所以,最好先用梯度PCR,普通的酶,确定最佳退火温度,然后再用高保真酶P目的片段。还有,你的目的条带是不是特别长,要根据不同长度设置 ...

我想知道是不是我具体的程序错了。说明书上没有预变形,是不是没有预变形,也没有终延伸那一步。说明书上虽然没有,这应该是公认的吧

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6楼2015-12-25 10:45:47
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)


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我最近也是啊,好烦,用的也是primestar这个。。。之前都跑的出来。。。

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7楼2015-12-25 11:06:54
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tfytli

金虫 (职业作家)


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换模板试一下,cDNA不好扩,换质粒模板试试

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最令人信服的话莫过于一本正经的胡说八道,外加一点数据。
8楼2015-12-25 11:26:16
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X小天T

金虫 (正式写手)


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引用回帖:
6楼: Originally posted by 宋宋6 at 2015-12-25 10:45:47
我想知道是不是我具体的程序错了。说明书上没有预变形,是不是没有预变形,也没有终延伸那一步。说明书上虽然没有,这应该是公认的吧
...

takara,预变性温度我们用的95℃,变性温度,普通的94℃ 变性时间30s。高保真是98℃ 变性时间10s,我们是这么做的。

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9楼2015-12-25 12:24:25
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木南楠

新虫 (初入文坛)


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什么酶可以代替primestar吗?overlap PCR两个扩增片段连接,想用别的酶代替primestar,不知道可不可以,求助大神!
10楼2016-05-31 21:26:59
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