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letliufly

金虫 (小有名气)

[求助] 为什么标记在DNA的亚甲基蓝的电化学信号不断降低?谢谢大家了! 已有2人参与

传统电化学生物传感,利用标记在DNA上的亚甲基蓝作为电信号分子(DNA另外一端标记有巯基用于修饰在金电极上)。 原理中,应该目标物出现,亚甲基信号升高。但是,当加入目标DNA的时候,亚甲基蓝信号却降低了好几倍。请问这是什么原因???(DNA杂交是在HEPES溶液里面。电信号扫描是在Tris-HCl溶液里,pH=7.4)
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cqzhangzhang

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
letliufly(pengtao1203代发): 金币+3 2015-12-12 00:45:36
无非俩原因,修饰不牢固和杂交不成功。要解决这俩问题难得很。也就是说这俩问题是电化学核酸传感器的技术瓶颈。
2楼2015-12-11 14:15:46
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olea

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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letliufly(pengtao1203代发): 金币+25 2015-12-12 00:45:12
你的信号分子是先修饰到电极上的是吧,是假定没上去目标DNA的时候是远离电极表面的,然后设计目标DNA上去后拉近电极表面的原理吗?
这个方法有些问题,因为单链DNA不是刚性的,有可能开始的时候信号分子就接近表面了。还要一个问题是有可能上去的目标DNA多了也会一定程度阻碍电极表面电荷传递。
后来别人改进的就是用个稍微长点的链,开始假设是接近表面的,然后目标上去后双链有一定刚性,拉直了后信号分子远离,这个稍微好一点。
当然了刚开始做有个问题是如果有部分信号分子是吸附上去的,在杂交的过程中脱落也是有可能的。
3楼2015-12-11 14:31:09
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letliufly

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cqzhangzhang at 2015-12-11 14:15:46
无非俩原因,修饰不牢固和杂交不成功。要解决这俩问题难得很。也就是说这俩问题是电化学核酸传感器的技术瓶颈。

跑电泳是显示杂交成功的。修饰不牢固的话,那该怎么弄呢
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4楼2015-12-11 15:34:21
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letliufly

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by olea at 2015-12-11 14:31:09
你的信号分子是先修饰到电极上的是吧,是假定没上去目标DNA的时候是远离电极表面的,然后设计目标DNA上去后拉近电极表面的原理吗?
这个方法有些问题,因为单链DNA不是刚性的,有可能开始的时候信号分子就接近表面 ...

我的原理是刚开始时候形成双链,由于刚性结构,亚甲基蓝远离电极表面,信号低。当目标DNA存在时候,竞争,使修饰亚甲基蓝的DNA变成单链,进而变成分子信标,亚甲基靠近电极,信号变强。但是悲剧是,加目标物后,亚甲基蓝信号没身高,反而降低了好几倍。
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5楼2015-12-11 15:37:37
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cqzhangzhang

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by letliufly at 2015-12-11 15:34:21
跑电泳是显示杂交成功的。修饰不牢固的话,那该怎么弄呢...

电泳只能说明在溶液中可以进行反应。证明不了在电极上也能杂交。修饰不牢固是工艺问题,我们解决不了。
6楼2015-12-11 15:43:45
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letliufly

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cqzhangzhang at 2015-12-11 15:43:45
电泳只能说明在溶液中可以进行反应。证明不了在电极上也能杂交。修饰不牢固是工艺问题,我们解决不了。...

好吧,好心累。谢谢你了!
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7楼2015-12-11 15:45:31
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olea

专家顾问 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by letliufly at 2015-12-11 15:37:37
我的原理是刚开始时候形成双链,由于刚性结构,亚甲基蓝远离电极表面,信号低。当目标DNA存在时候,竞争,使修饰亚甲基蓝的DNA变成单链,进而变成分子信标,亚甲基靠近电极,信号变强。但是悲剧是,加目标物后,亚 ...

竞争上去还稍微简单点,要竞争下来的话电极表面的目标DNA浓度要很大才行,特别是亲和力相差不是非常大的时候。
有一种可能是目标DNA直接吸附上去了,不但没弄下来先上去的那个DNA反而增大的了电极的电阻。
8楼2015-12-11 15:56:57
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letliufly

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by olea at 2015-12-11 15:56:57
竞争上去还稍微简单点,要竞争下来的话电极表面的目标DNA浓度要很大才行,特别是亲和力相差不是非常大的时候。
有一种可能是目标DNA直接吸附上去了,不但没弄下来先上去的那个DNA反而增大的了电极的电阻。...

但是这之前先用了1 mM的MCH封闭了电极。同时电阻变小,显示DNA被竞争走了
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9楼2015-12-11 18:09:39
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ZDLT201314

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by olea at 2015-12-11 14:31:09
你的信号分子是先修饰到电极上的是吧,是假定没上去目标DNA的时候是远离电极表面的,然后设计目标DNA上去后拉近电极表面的原理吗?
这个方法有些问题,因为单链DNA不是刚性的,有可能开始的时候信号分子就接近表面 ...

你好,最近我刚好也在做亚甲基蓝,因为我做的是两条链分别标记了二茂铁和亚甲基蓝,电化学测出来的结果亚甲基蓝的信号比二茂铁强好多,老师给我的建议是氧气的影响。随后我在电解质溶液里充氮除氧之后,亚甲基蓝的信号减弱了,但还是比二茂铁信号强,请问这是正常现象吗?
10楼2015-12-29 16:14:40
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