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引物设计及PCR相关问题已有2人参与
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各位，本人研三，之前师姐师兄在的时候好多问题没搞明白他们就毕业了，最近有问题，只能上小木虫求助一下。 最近在做酶的克隆表达，想从筛选到的菌株中钓取酶基因，之前设计了一对引物，特异性不是很好，可能有错配，导致PCR产物有非特异性条带，之后做过目的条带胶回收之后作为模板，也做过退火温度梯度，还降低过模板量和引物浓度，都没有特别好的单一条带的结果。于是纠结是不是要重新设计一对引物，这次换了个目的条带，用PP5设计的引物，至少保证了不加酶切位点的时候没有错配，可是发现不加酶切位点的时候评分可以达到100，但是加了酶切位点之后就又出现了二聚体和发卡。情况大概介绍完了，总结一下要问的问题： 1． 加酶切位点之后评分降低，怎么解决？可以直接用吗？还是需要做一些调整？另外加了酶切位点之后，产生了一个六个碱基左右的错配，这样的引物还能用吗？可是错配中有四个碱基是由酶切位点引起的，而我现在没办法换酶切位点，怎么解决？ 2． 两个引物之间Tm值和GC比相差较大？如何解决？如果用同义密码子进行替换，是否会对引物的特异性产生影响。 3． 之前做二次PCR的时候，做了个温度梯度，同时平行做了两管，出现了一管有条带，另一管全是抹带，一会上图，大家给鉴定一下原因呗？DL2000 marker 之后四个分别是退火温度为48,50,52,54. 左右两块胶是平行的两管。 4． 最近跟老师讨论PCR，他说我的操作不规范，应该将每种东西都打到侧壁上，之后用手指轻弹管壁，用溅起的水珠将壁上的液滴冲洗下去，离心后再进行PCR，而我之前的做法都是加完水之后将所有东西都加到液面以下，老师说我们的枪头不是进口的，会带出来一些液体，想问一下大家都是怎么做的？两种方法有很大差异吗？ 5． 看到有人说可以拿设计的引物在NCBI上blast一下，研究了许久，都未成功，可否有哪位大神指点一下具体步骤？ 6． 想问一下正引物这样的，在酶切位点之前加了两个保护碱基，翻译的时候是否会引起位移？另外，大肠杆菌表达的时候是否利用TTG当起始密码子的比较少？第一次设计的引物是： 正：5'> CGGGATCCATGTTGTCTAGACGTCGTATCG <3' 反：5'> CCCAAGCTTTCAACAGTACAGGTTGCCG <3' 目的片段是： TTGTCGAGACGCCGTATCGCCGCCGTCACCGCCGCCCTCGTCCTCGCCGGAAGCGCCCCGATGCTGCTCCCCGCCGCGGCCACCACCGCCTCGGCCGCCACCGCGGCCGCGTGTTCTAGCTACCCCGCCTGGGTCGCCGGACAGTGGTACGAGGCCGGTGCGATCGTCCGTTACACCGACGGCAAGGCGTACATCGCCGAGCACGCCAACCCGGGTTACGACCCGACCGTCAGCACCTGGTACTGGGAGCCCTACGCCTGTGACAACGGGCCCGGGACGCCCGTCGGGAACTTCGTCGTGACCGAGGCACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAACCGGAACCCCTTCTACACCTACAGCGGCCTCACCGCCGCGCTCAGCGCCTACCCCGGCTTCGCCAACACCGGGAGCGACACGGTGAAGAAGCAGGAGGCCGCCGCCTTCCTCGCCAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGTCTGGTCCACGTCGTGGAGCAGAACCAGGCCAACTACCCGCACTACTGCGACTGGGGCCGGCCGTACGGCTGCCCGGCCGGCCAGGCCGCCTACTACGGGCGCGGTCCCATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCGGGCGACGCGTTGGGCATCGACCTGCTGAACAACCCCTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCCGTCGCCTGGAAGACCGCCCTCTGGTACTGGAACACCCAGACCGGTCCGGGCAGCATGACCGGCCATGCCGCCATGGTGAACGGGGCCGGTTTCGGCCAGACGATCCGCAGCATCAACGGCTCGCTGGAGTGCGACGGCAGGAACCCGGCGCAGGTCCAGAGCCGGGTGACGAAGTACCAGCAGTTCACCCAGATCCTCGGGACGACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA 7.第二次设计的引物是： 正：5'> CGCGGATCCATGCCATCCCCCCACCGCT<3' 反：5'> CCCAAGCTTCTACCGGATGGCCTTGAT<3' 目的片段是：ATGCCATCCCCCCACCGCTCCCGCACGCTGCGGGCGCTCGTGTCCGCCGCCTGTACCGCCGTGCTCGGCGCCGGACTGCTCGCCGGCACGGGCGCCTCGACCGCCACCGCGGCGACCTCGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGGTTCGAAGGTCGTCGGCTACTTCACCGAATGGGGCACCTACGACCGGCAGTACTACGTCAGGAACATCGAGACGTCCGGGTCCGCGGACCGGCTCACCCACATCAACTACGCCTTCGGCAACGTCACCGGCGGCAAGTGCGCCATCGGCGACGCCTACGCGGCCACCGACCGCGCCTACACCGCCGAGGAGTCCGTCGACGGAGTCGCGGACACCTGGGACCAGCCGCTGCGCGGCACCTTCAACCAGCTGCGGAAGCTGAAGGAGAAGCACCCCGGCCTCAAGGTGATCTGGTCCTTCGGCGGCTGGACCTGGTCCGGCGGCTTCGGCGAGGCCGCGAAGAACCCGGCCGCCTTCGCGCAGTCCTGCCTGGACCTGGTGGAGGACCCGCGCTGGGCCGGCGTCTTCGACGGCATCGACATCGACTGGGAGTACCCGAACGCCTGCGGCGCCACCTGCGACACCAGCGGCCGTGACGCCTACCGCGAACTGATGGCGGCGCTGCGCTCCACGTTCGGCCCCGACCGGCTGGTCACCGCCGCGATCCCGGCCGACGCCACCGACGGCGGCAAGATCGACGCGGCCGACTACGCCGGCGCCGCCCCGTACGTCGACTGGTACAACCCGATGACGTACGACTTCTTCGGCGCCTGGGACACCGCCGGGCCGACCGCCCCGCACTCGCCGCTGACCTCGTACGACGGCATCCCGAAGGCGGAGTACCACAGCGCCGCCACCATCGCGAAGCTGACCGGTCTCGGCGTCCCCGCGGACAAGCTGCTGCTCGGCATCGGCTTCTACGGCCGCGGCTGGACCGGCGTCACCCAGGCGGAGCCGGGCGGCACCGCGACCGGCCCCGCGCCGGGCACGTACGAGGCGGGGATCGACGACTACAAGGTCCTCAAGGACAGGTGCCCCGCGACCGGCACGGTCGGCGGCACCGCCTACGCCCGGTGCGGCGACCAGTGGTGGAGCTACGACACCCCGGAGACCGTCGCCTCCAAGACGGAGTGGAAGAACCAGCAGGGCCTCGGCGGCACGTTCTTCTGGGAGCTCAGCGGCGACACCGCGAACGGTGAGCTGATCAAGGCCATCCGGTAG   退火温度梯度.JPG |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1.评分降低没有关系啊，十全十美的引物很少，能扩出你的片段就行。至于你的错配碱基，为什么不能换酶切位点，表达载体一般不都好多个酶切位点吗？真不能换那就只能这样了。 2.两个引物之间Tm值比较大的话，可以用touch down程序跑。 3.退火温度我最低用过50度，温度越低，引物的特异性结合越差，可以试试提高退火温度，比如60度。 4.你老师说的很对，但我觉得影响不大，按照你的方法加的话，你加完后可以用枪头稍微吹打几下再离心。 5.我也没做过引物比对。。。 6.保护碱基切掉了不影响。TTG的起始密码子？没听说过啊，可能我孤陋寡闻了 最后，有杂带不要紧啊，里面只要有你的目的条带就行，你最终不是要做蛋白表达吗？把大小符合的条带切下来回收测序，做连接转化表达就是，何必纠结pcr的条带单一不单一？ |
5楼2015-12-11 12:18:56
2楼2015-12-10 22:43:36
3楼2015-12-10 23:50:50
uulovelyuu
至尊木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1. 可以用，酶切位点对你片段的扩增没有任何影响啊。但要注意一点，你是做表达，所以序列要对框，也就是如果你的蛋白前边有标签或者从载体序列开始翻译，要保证能够跟你的蛋白ORF对上。 2.可以通过增加酶切位点的保护碱基来进行调节。 3.PCR有些扩不出来原因比较难说，但你有的样本能出来，说明体系问题不大。建议不要纠结失败的原因，用括出来的片段继续往前走，保持实验进度推进。 4. 我认为你的做法是对的，而且我也是这么做的，没啥问题。注意先配好缓冲体系，其他成分逐步往里加。 5. 直接去NCBI 的blast就可以，选类型（蛋白or核酸），物种等，然后SUBMIT 6. 保护碱基不会引起突变，因为酶切的时候都切掉了啊。起始密码子是ATG，没听说过TTG。 希望有所帮助。 |
4楼2015-12-11 09:57:11