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alanyatou

新虫 (初入文坛)

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[求助] 引物设计及PCR相关问题已有2人参与

各位，本人研三，之前师姐师兄在的时候好多问题没搞明白他们就毕业了，最近有问题，只能上小木虫求助一下。
最近在做酶的克隆表达，想从筛选到的菌株中钓取酶基因，之前设计了一对引物，特异性不是很好，可能有错配，导致PCR产物有非特异性条带，之后做过目的条带胶回收之后作为模板，也做过退火温度梯度，还降低过模板量和引物浓度，都没有特别好的单一条带的结果。于是纠结是不是要重新设计一对引物，这次换了个目的条带，用PP5设计的引物，至少保证了不加酶切位点的时候没有错配，可是发现不加酶切位点的时候评分可以达到100，但是加了酶切位点之后就又出现了二聚体和发卡。情况大概介绍完了，总结一下要问的问题：
1．加酶切位点之后评分降低，怎么解决？可以直接用吗？还是需要做一些调整？另外加了酶切位点之后，产生了一个六个碱基左右的错配，这样的引物还能用吗？可是错配中有四个碱基是由酶切位点引起的，而我现在没办法换酶切位点，怎么解决？
2．两个引物之间Tm值和GC比相差较大？如何解决？如果用同义密码子进行替换，是否会对引物的特异性产生影响。
3．之前做二次PCR的时候，做了个温度梯度，同时平行做了两管，出现了一管有条带，另一管全是抹带，一会上图，大家给鉴定一下原因呗？DL2000 marker 之后四个分别是退火温度为48,50,52,54. 左右两块胶是平行的两管。
4．最近跟老师讨论PCR，他说我的操作不规范，应该将每种东西都打到侧壁上，之后用手指轻弹管壁，用溅起的水珠将壁上的液滴冲洗下去，离心后再进行PCR，而我之前的做法都是加完水之后将所有东西都加到液面以下，老师说我们的枪头不是进口的，会带出来一些液体，想问一下大家都是怎么做的？两种方法有很大差异吗？
5．看到有人说可以拿设计的引物在NCBI上blast一下，研究了许久，都未成功，可否有哪位大神指点一下具体步骤？
6．想问一下正引物这样的，在酶切位点之前加了两个保护碱基，翻译的时候是否会引起位移？另外，大肠杆菌表达的时候是否利用TTG当起始密码子的比较少？第一次设计的引物是：
正：5'> CGGGATCCATGTTGTCTAGACGTCGTATCG <3'
反：5'> CCCAAGCTTTCAACAGTACAGGTTGCCG <3'
目的片段是：
TTGTCGAGACGCCGTATCGCCGCCGTCACCGCCGCCCTCGTCCTCGCCGGAAGCGCCCCGATGCTGCTCCCCGCCGCGGCCACCACCGCCTCGGCCGCCACCGCGGCCGCGTGTTCTAGCTACCCCGCCTGGGTCGCCGGACAGTGGTACGAGGCCGGTGCGATCGTCCGTTACACCGACGGCAAGGCGTACATCGCCGAGCACGCCAACCCGGGTTACGACCCGACCGTCAGCACCTGGTACTGGGAGCCCTACGCCTGTGACAACGGGCCCGGGACGCCCGTCGGGAACTTCGTCGTGACCGAGGCACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAACCGGAACCCCTTCTACACCTACAGCGGCCTCACCGCCGCGCTCAGCGCCTACCCCGGCTTCGCCAACACCGGGAGCGACACGGTGAAGAAGCAGGAGGCCGCCGCCTTCCTCGCCAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGTCTGGTCCACGTCGTGGAGCAGAACCAGGCCAACTACCCGCACTACTGCGACTGGGGCCGGCCGTACGGCTGCCCGGCCGGCCAGGCCGCCTACTACGGGCGCGGTCCCATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCGGGCGACGCGTTGGGCATCGACCTGCTGAACAACCCCTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCCGTCGCCTGGAAGACCGCCCTCTGGTACTGGAACACCCAGACCGGTCCGGGCAGCATGACCGGCCATGCCGCCATGGTGAACGGGGCCGGTTTCGGCCAGACGATCCGCAGCATCAACGGCTCGCTGGAGTGCGACGGCAGGAACCCGGCGCAGGTCCAGAGCCGGGTGACGAAGTACCAGCAGTTCACCCAGATCCTCGGGACGACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA
7.第二次设计的引物是：
正：5'> CGCGGATCCATGCCATCCCCCCACCGCT<3'
反：5'> CCCAAGCTTCTACCGGATGGCCTTGAT<3'
目的片段是：ATGCCATCCCCCCACCGCTCCCGCACGCTGCGGGCGCTCGTGTCCGCCGCCTGTACCGCCGTGCTCGGCGCCGGACTGCTCGCCGGCACGGGCGCCTCGACCGCCACCGCGGCGACCTCGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGGTTCGAAGGTCGTCGGCTACTTCACCGAATGGGGCACCTACGACCGGCAGTACTACGTCAGGAACATCGAGACGTCCGGGTCCGCGGACCGGCTCACCCACATCAACTACGCCTTCGGCAACGTCACCGGCGGCAAGTGCGCCATCGGCGACGCCTACGCGGCCACCGACCGCGCCTACACCGCCGAGGAGTCCGTCGACGGAGTCGCGGACACCTGGGACCAGCCGCTGCGCGGCACCTTCAACCAGCTGCGGAAGCTGAAGGAGAAGCACCCCGGCCTCAAGGTGATCTGGTCCTTCGGCGGCTGGACCTGGTCCGGCGGCTTCGGCGAGGCCGCGAAGAACCCGGCCGCCTTCGCGCAGTCCTGCCTGGACCTGGTGGAGGACCCGCGCTGGGCCGGCGTCTTCGACGGCATCGACATCGACTGGGAGTACCCGAACGCCTGCGGCGCCACCTGCGACACCAGCGGCCGTGACGCCTACCGCGAACTGATGGCGGCGCTGCGCTCCACGTTCGGCCCCGACCGGCTGGTCACCGCCGCGATCCCGGCCGACGCCACCGACGGCGGCAAGATCGACGCGGCCGACTACGCCGGCGCCGCCCCGTACGTCGACTGGTACAACCCGATGACGTACGACTTCTTCGGCGCCTGGGACACCGCCGGGCCGACCGCCCCGCACTCGCCGCTGACCTCGTACGACGGCATCCCGAAGGCGGAGTACCACAGCGCCGCCACCATCGCGAAGCTGACCGGTCTCGGCGTCCCCGCGGACAAGCTGCTGCTCGGCATCGGCTTCTACGGCCGCGGCTGGACCGGCGTCACCCAGGCGGAGCCGGGCGGCACCGCGACCGGCCCCGCGCCGGGCACGTACGAGGCGGGGATCGACGACTACAAGGTCCTCAAGGACAGGTGCCCCGCGACCGGCACGGTCGGCGGCACCGCCTACGCCCGGTGCGGCGACCAGTGGTGGAGCTACGACACCCCGGAGACCGTCGCCTCCAAGACGGAGTGGAAGAACCAGCAGGGCCTCGGCGGCACGTTCTTCTGGGAGCTCAGCGGCGACACCGCGAACGGTGAGCTGATCAAGGCCATCCGGTAG